内毒素在高糖高脂饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎大鼠中作用机制研究.docVIP

内毒素在高糖高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠中的作用机制研究 　　【摘要】 目的：观察高糖高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝脏巨噬细胞、血浆肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达及肝细胞凋亡变化特点，探讨内毒素（LPS）在大鼠NASH发生发展中的作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为9周组：Synthetic diet+saline组、Synthetic diet+LPS组、Regular diet+LPS组和Regular diet+saline组；以及5周组：Synthetic diet组和Regular diet组，并在第5周末处死以观察高糖高脂饮食对大鼠肝脏影响。自第6周开始，9周组大鼠隔日皮下注射LPS 0.5 mg/kg或相同剂量的0.9%氯化钠注射液，在9周末处死检测其血浆LPS、ALT与TNF-α水平，并观察肝脏病理变化、测定肝脏CD68的表达与肝细胞凋亡水平。结果：5周Synthetic diet组肝脏有轻度脂肪变性。9周Synthetic diet+LPS组与其对照组Synthetic diet+saline组和Regular diet+LPS组相比，血浆LPS、ALT与TNF-α表达水平、CD68表达与细胞凋亡率均显著升高，差异均有统计学意义（P 　　【Key words】 Lipopolysaccharide； Non-alcoholic steatohepatitis； Macrophage； Tumor necrosis factor-α； Apoptosis 目前肥胖及其相关疾病在全球呈现流行趋势，是医学界面临的一大挑战，非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一临床和病理学术语，疾病范围包括从简单的甘油三酯在肝细胞积累，肝脂肪变性和炎症、纤维化和肝硬化，常见于肥胖患者[1]。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoho lic steatohepatitis，NASH）是NAFLD的一种，为发达国家引起慢性肝脏疾病的最常见原因，它会导致肝硬化和肝细胞癌的风险增加[2-4]。因此明确NASH发病机制，阻止其病情进一步恶化，已成为当今医学界研究热点 近年来的许多研究已证实肠源性内毒素（LPS）血症在NASH的形成发展中有着重要作用[5]，在前期研究笔者发现在NASH中肝细胞凋亡率随病情加重而升高，提示肝细胞凋亡在NASH的病理发展过程中是一个极为重要的因素[6]，但是目前LPS引起肝细胞凋亡机制尚不明确，本研究旨在通过高脂高糖饮食诱导建立NASH大鼠模型，多次小剂量注射LPS观察肝脏巨噬细胞与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）的表达及肝细胞凋亡变化特点来探讨LPS在NASH大鼠中的作用机制 1 材料与方法 1.1 实验动物 雄性SD大鼠30只，体重200～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供 1.2 主要试剂 丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；LPS测定鲎试剂盒（上海伊华临床医学科技公司）；TNF-α放免试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所）；CD68小鼠抗大鼠单克隆抗体（Abcame公司），二抗免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），TUNEL检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司） 1.3 方法 1.3.1 实验动物分组及模型建立 30只雄性SD大鼠均给予标准基础饲料，自由进食饮水3 d后，设立9周组：Synthetic diet+saline 组、Synthetic diet+LPS组、Regular diet+LPS组、Regular diet+saline组，每组5只。另外设立5周组，Synthetic diet组与Regular diet组，每组5只，在第5周末麻醉处死该组大鼠以观察高糖高脂对大鼠肝脏影响。Synthetic饮食配方为含68.75%普通饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇+0.25%胆酸。自第6周开始，9周组大鼠在相同条件下隔天皮下注射LPS 0.5 mg/kg或相同剂量的0.9%氯化钠注射液，所有大鼠自由进食与饮水。在实验第9周末，1%戊巴比妥钠3 mL/kg腹腔注射麻醉动物，无菌无热原条件下取腹主动脉血，3500 rpm离心后取血浆备用，取肝左叶10%福尔马林固定，石蜡包埋5 μm切片备用，余肝组织置于-70 ℃冰箱备用 1.3.2 病理学检查 石蜡切片做HE染色，在光镜下观察肝组织病理变化 1.3.3 生化