双报告基因标记乳腺癌细胞移植瘤模型建立与活体成像研究.doc

双报告基因标记乳腺癌细胞移植瘤模型的建立及活体成像研究 　　摘要：目的 探索双报告基因标记技术用于建立乳腺癌小鼠移植瘤模型并进行活体成像研究的可行性。方法 利用慢病毒转染技术将绿色荧光蛋白（eGFP）和荧光素酶（Fluc）融合基因标记人乳腺癌MDA-MB-231细胞，利用流式细胞术筛选建立稳定细胞系，利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染率，体外细胞成像检测Fluc的表达；将转染后的231细胞接种至NOD/SCID小鼠皮下建立移植瘤模型，活体成像监测移植瘤Fluc的发光。结果 荧光显微镜下观察建立的稳定细胞系中GFP表达率高，流式测定表达率95.2%，传代扩增5次后表达率无明显变化。体外细胞成像检测到明显的Fluc发光，信号强度与细胞数成正比。所有实验小鼠均接种成功，可观察到Fluc信号强度随时间逐渐增强。结论 慢病毒介导的Fluc-eGFP双报告基因标记可用于体内移植瘤活体成像，为乳腺癌相关机制及治疗研究提供了直观，准确的平台 关键词：荧光素酶；绿色荧光蛋白；活体成像；乳腺癌 近年来新兴的活体成像技术为生物医学研究提供了新的平台。其可从细胞或亚细胞水平对体内的生物学过程进行直观观察和量化分析，具有操作简单，灵敏度高，无创性，观测结果的直观性和连续动态性等特点[1-2]ENREF1。 相对于荧光素酶生物发光成像较强的特异性和高信噪比，荧光成像应用于活体内时因其需要激发光源而造成较强的背景噪音，灵敏度较低，而用于体外细胞及组织标记具有一定优势。利用荧光蛋白和荧光素酶对细胞或动物进行双重标记，前者可用于体外检测和细胞生物学观察，后者用来进行活体动物体内追踪研究[3-4]ENREF1。本研究构建了稳定表达萤火虫荧光素酶-绿色荧光蛋白（Fluc-eGFP，DF）的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系，并在NOD/SCID小鼠建立乳腺癌皮下移植瘤模型，并应用活体成像示踪监测标记的乳腺癌细胞在小鼠体内的分布、存活及增殖 1资料与方法 1.1一般资料 细胞，质粒和实验动物：人乳腺癌MDA-MB-231细胞系购自ATCC，人胚肾细胞系293T， Flu-eGFP慢病毒表达质粒（图1）由南开大学医学院免疫学实验室惠赠。6～8周龄健康NOD/SCID雌性小鼠，购自北京大学医学部实验动物科学部，饲养于SPF级环境 1.2试剂及仪器 DMEM 培养基，Fluc底物luciferin，活体成像设备（IVIS 200），流式细胞仪 1.3方法 1.3.1慢病毒的包装 将生长旺盛的293T细胞以1*106的密度接种在6孔板内。细胞密度达到90%融合度进行转染。将转染试剂和三种慢病毒包装质粒混合，静置20 min后加入293T细胞培养孔内，4 h后添加2 ml全培养基，16 h后换液，换液24 h后收集病毒上清 1.3.2慢病毒感染MDA-MB-231细胞及阳性细胞的筛选 将231细胞以10%的密度接种在六孔板内，加入1ml慢病毒上清，2 ml DMEM培养基，24 ug Polybrene。常温下1600 r/min离心1 h。换成全培养基培养扩增。用流式分选出GFP表达阳性的细胞群。荧光显微镜观察GFP的表达情况 1.3.3 Fluc-eGFP标记的MDA-MB-231细胞GFP和Fluc表达分析 利用流式细胞术检测构建的231-DF细胞系中GFP表达率。231-DF细胞消化后分别以不同梯度的细胞密度接种入6孔板内。培养1 d后应用活体成像仪检测Fluc的表达。成像时向6孔板每个孔内加入500 ul底物溶液（1：100稀释），扫描时间1 s。用living imaging 软件分析处理数据 1.3.4小鼠皮下移植瘤模型的建立 将培养的状态良好的231-DF细胞消化，制备单细胞悬液，调整细胞数为2×107/ml，用水合氯醛麻醉小鼠，100 ul上述细胞悬液注射至小鼠两侧肩部皮下 1.3.5活体成像监测移植瘤的生长状况 自接种第2 d起，每7 d应用活体成像检测接种小鼠体内Fluc发光信号，研究移植瘤的生长情况。每只小鼠成像前腹腔注射200 ml的荧光素酶底物，气体麻醉后放入样本暗箱内成像，扫描时间30 s 2结果 2.1慢病毒感染231细胞及阳性细胞的筛选 荧光显微镜下观察231细胞转染率在80%左右。流式分选出GFP阳性细胞群，GFP表达率在95%左右，经传代扩增5次后表达率无明显变化，见图2 2.2 231-DF细胞Fluc表达分析 在6孔板连续的5个孔内，随着细胞密度依次递增，荧光信号的强度也依次增强（图3）。说明我们用DF标记的231细胞表达的Fluc蛋白在体外能够使用活体成像检测到。以荧光信号强度对细胞数做一线性回归分析（图3），R2=0.99，表示荧光强度与细胞数之间存在线性正相关。上述