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异羟肟酸对宫颈癌细胞生长抑制作用的研究 　　【中图分类号】R490.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2016）12-0-01 组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDI）是一类特异性抑制组蛋白去乙酰化酶、促进染色质解螺旋、增强其趋近性，从而调节基因转录的小分子化合物。体内、外研究证明组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成及转移、降低肿瘤侵袭力等机制发挥抗肿瘤作用，与放射联合还有放射增敏作用[1] 近来研究表明， 异羟肟酸有组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase ， HDAC）抑制剂活性， 可抑制多种肿瘤细胞生长。异羟肟酸被广泛称为低毒性HDAC抑制剂。Tambunan US[2]等研究提出了利用苯三唑对异羟肟酸修改，获得一个更好的抑制剂。本研究观察异羟肟酸对宫颈癌Hela 和Siha 细胞株生长和细胞周期的影响及p53mRNA 和蛋白表达改变 1.材料与方法 1.1 材料 异羟肟酸购自Sigma 公司，用PBS 稀释成500mmol/L， 过滤分装，贮藏于- 20℃。P53抗体购自Santa Cruz 公司，为鼠抗人单抗。RPMI-1640 （Gibco 公司）。TRIZOL 试剂购自Invitrogen 公司。新生牛血清（杭州四季青）。FACSort 流式细胞仪为美国Becton Dickson 公司产品。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinV-FITC 凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson 公司产品 1.2 实验方法 1.2.1 细胞和细胞培养 Hela 和Siha 细胞株由本科室保存。细胞在5% CO2、37℃条件下，用含10% 新生牛血清、青霉素（100U/ml）、链霉素（100U/ml）的RPMI-1640 培养液培养传代 1.2.2 MTT 实验检测生长抑制率 取对数生长期宫颈癌细胞，按细胞浓度为5×104/ 孔接种于96 孔板。37℃、5%CO2 饱和湿度培养24h 后， 分别加入不同浓度SAHA（0， 1.2， 2.4， 5.0 mM） 的培养基，每孔200μl，对照组不做处理。分别于加药后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT 溶液（5mg/ml）20μl， 37℃避光培养4h。彻底吸去MTT 溶液，加入二甲基亚砜150μl/孔， 震荡10min， 酶标仪490nm激发波长检测吸光度。计算细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（1- 实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。每次实验设3 复孔， 实验重复3 次 1.2.3 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期 Hela 细胞和Siha 细胞分别用含（0， 1.2， 2.4， 5.0 mM） SAHA的培养基培养48h 。胰酶消化成单细胞悬液， 1 000r/min 离心5min收集细胞， 加0.01mol/L PBS 洗涤离心2 次， 用4℃75% 乙醇固定过夜。1 000r/ min 离心5min ， 去掉乙醇固定液， PBS 洗涤2 次。加入PI 染液1ml（50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1% Triton-100）， 4℃孵育30min ， FCM检测凋亡细胞率 1.2.4 RT- PCR 检测p53表达 分别收集用含（0， 1.2， 2.4， 5.0 m M） SAHA处理48h的细胞。用TRIZOL 提取细胞总mRNA， 参照说明书进行。提取的mRNA 用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度（A260 /A2801.8）。取2μg mR-NA 为模板， 应用通用引物逆转录合成cDNA， 以cDNA 为模板进行PCR 扩增。P53 引物： 正义链5′-cctcttcggcccagtggac-3 ′， 反义链5′-ccgttttcgaccctgagag-3 ′，退火温度60℃， 共28 个循环， 扩增产物369bp ；β-actin 引物： 正义链5′-ggcatcgtgatggactccg-3 ′，反义链5′-gctggaaggtggacagcga-3 ′， 退火温度62℃， 共28个循环， 扩增产物594bp 。扩增条件为：94 ℃预变性3 min； 94 ℃ 40 s， 56 ℃ 40 s， 72 ℃ 1min， 30 个循环； 72 ℃延伸7 min。取PCR 产物5 μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳（ 100 V， 30 min） 。凝胶成像系统成像， 经薄层扫描求得每个待测产物与β-actin 产物光密度之比， 进行半定量分析。 PCR 产物在1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳， 电泳结果用英国UVP 公司GDS8000 型