认识色谱柱—反相色谱柱课件.pptx

色谱分离基本原理 “两相分配，相似相溶” 色谱柱结构 色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。 筛板的内部孔形态会影响柱效 规格 内径 长度 粒径 碳载量 孔径 比表面积 材质 封端 表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径 隐藏信息：碳载量，平均孔径，比表面积，封端，键合类型，pH范围，最大耐压，筛板孔径等 Waters XBridge Shield RP 18 4.6*250mm 5um 柱效 拖尾 载样量（体积） 载样量（浓度） 分离度 回收率 你能正确连接它们吗？ 填料 硅胶 等载体 （正相色谱） 硅胶+键合相 （反相色谱） 聚合物+键合相 （离子交换，手性色谱柱等） 整体柱 （空间排阻色谱等） 反相色谱C18填料 硅胶 注意： 硅胶 颗粒大小分布 金属残留 内部孔径 实心核颗粒 四乙氧基硅烷 (TEOS) 硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷 (MPEOS) 甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS) 改性硅胶 硅胶快速溶解 严重的柱失效 柱寿命短暂 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速度明显减缓 柱寿命大大延长 pH范围可达1~11 普通硅胶柱 waters改性硅胶柱 碱性条件下硅胶溶解 单、双、三官能团键合 三官能团键合 二官能团键合 单官能团键合 键合 碳载量 影响残留硅羟基比率 键合相流失率 键合密度 常见键合相 主要作用机理 疏水 疏水 π-π 疏水 疏水 氢键 π-π 氢键 氢键 阳离子交换 阴离子交换 空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷 增加pH范围，但有限，一般1~9 空间位阻 Agilent Phenomenex 空间位阻 抗水解 Agilent XDB 极性嵌入 Waters “Shield” 内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理 水 “屏蔽”层 改善与水的浸润性－100%水溶液兼容 降低了碱性化合物的保留 降低了拖尾现象 屏蔽了带负电的硅羟基 极性基团增加了表面层水的浓度 与键合相的疏水性作用 双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用 O- Si O- Si O - O- Si O- Si O - O- Si O - O- Si O- Si O- Si O - O-- Si O- Si O- Si O- Si OH O- Si O- Si OH O- Si OH O- Si O- Si O- Si OH O- Si O- Si 当流动相pH值小于3时, 硅醇基呈中性(未解离) Base Base 对碱性化合物的保留及严重拖尾 两实验使用相同的传统C8硅胶柱 离子交换作用 碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理 当流动相为 pH6-8时, 硅醇基带负电性(大部解离) 既然pH 3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离? 低pH可导致分离选择性的丧失!---碱性基团离子化，极性增加 常用封尾end-capped ：三甲基硅氧烷 极性封尾，增加极性保留 由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。 封端 封端 –封口残余硅羟基 –减少不可逆吸附或拖尾 –增加碳含量（0.1% -1%） 封端 现代色谱柱三大技术平台 亲水AQ柱 ECOSIL ODS-AQ Atlantis Dc18, T3 Synergi Hydro-RP HILIC柱 Zic-HILIC Hypersil GOLD HILIC Atlantis HILIC 柱 目的：提高极性化合物保留 宽pH色谱柱 ECOSIL ODS-Extend Xbridge/Xterra C18/C8 Gemini C18 Zorbax Extend 目的：提高色谱柱pH使用范围 纯硅胶柱 ECOSIL ODS-SH Purospher STAR RP18e Symmetry C18 极性嵌入柱 ECOSIL ODS-EPS Zorbax-Bonus RP18 Symmetry shield RP18 目的：改善峰形 未湿润的孔 湿润的孔 注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！ 低比例有机溶剂或纯水溶液流动相 C18 硅胶 什么是“疏水塌陷”？ 疏水塌陷 分 流动相：0.1% 醋酸水溶液 阿莫西林 Vo：被分析物没有保留 “湿润时” “去湿后” 疏水塌陷 此时色谱柱并没有“坏”，如何复原： 低比例有机相低流速冲洗过渡，然