产纤维素酶细菌的剖析.pptx

产纤维素酶细菌的筛选及酶特性的研究 组长：赵凡 组员：管融资、史章、朱瑾、张菲菲、胡锐 实验大纲 一、摘要 二、实验材料 三、实验步骤 四、预期结果 一、摘要： 本实验以腐烂的废纸浆为原料，首先经反复筛选及刚果红染色鉴定，获得一株高活力纤维素酶生产细菌。再经摇瓶中产酶，试验得到纤维素酶，其次探究产生的纤维素酶的部分特性（最适PH，对O2需求）。 二、实验材料 1、废纸浆，培养皿，接种环，250ML酶，三角瓶，酒精灯等 2、三种培养基 ①筛选培养基A：蛋白胨10g，酵母粉10g。羟甲基纤维素钠（CMC—Na）10g，NaCl 5g，KH2PO4 1g，琼脂粉18g及蒸馏水1000ml，用H2SO4或NaOH调不同的PH值。 ②筛选培养基B：KH2PO4 2g，（NH4）SO4 1.4g，MgSO4 0.3g，CaCl 0.3，FeSO4 5mg，MnSO4 1.6mg，ZnCl 1.7mg，CoCl2 2.0mg，CMC 20g。琼脂粉18g及蒸馏水1000ml。用H2SO4或NaOH调PH。 ③液体培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉1.0％，CMC 1.0％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.1％，另配Na2CO3 10％，分开灭菌后与上述培养基成分按1:9的比例混合均匀，是培养基的初始PH为9.5—10.0 三、实验步骤 1、产纤维素酶细菌的筛选 ①涂布：将废纸浆充分打匀，取少量悬浊液经稀释后，分别涂布于PH为7.0和10.0的筛选平板A上，37℃恒温培养48H。 ②转移：用接种环将筛选平板A上出现的细菌菌落分别转移到相应PH为7.0和10.0的筛选平板B上，于37℃条件下恒温培养48H。 ③获得纯培养：根据菌落形态和生长情况，挑选获得菌落，进一步划线分离，在筛选平板B上经过多次分离纯化，最后获得细菌的纯培养。 ④染色：将待鉴定的菌落用接种环转移到一定PH值得筛选培养基B上，37℃恒温培养2—4d，往培养皿中加入适量1mg/ml的红景天溶液，染色1h，弃去染液，加入适量1mol/L的NaCl溶液，洗涤1h。 若细菌产生纤维素酶（CMC酶）则在菌落周围会出现清晰地透明圈，选择一个生长状况良好的菌株。 2、摇瓶产酶实验 ①制液体菌种：将筛选到的菌种由培养斜面接种到30ml，（250ml的三角瓶）的液体培养基中，于37℃ 200r/min下培养36—48h，制成液体菌种。 ②产酶实验：按1％的接种量将液体菌种加入到50ml，（250ml的三角瓶）液体培养基中，在37℃，180r/min下进行产酶实验，定时取样测定发酵液中的CMC酶活力。 3、酶特性研究 1、最适生长PK值：将筛选到菌株转变一道PH分别为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0的筛选平板A上37℃，恒温培养3d，观察结果。 2、对O2的需求：通过穿刺培养观察菌的生长情况。 四、预期结果 1、产生纤维素酶细菌的筛选 用刚果红鉴定筛选到的纯培养，其中有产生大而清晰地透明圈，直径较大菌落的平板。 2、最适生长PH值在7.0左右 通过穿刺培养可见菌只在培养基表面生长，深处不生长。