产脂肪酶丝状真菌的分离及优化培养条件剖析.pptx

产脂肪酶丝状真菌的分离及培养条件优化 指导老师：侯运华 班级：生技12-1 学生：贾晓君 学号：201206011083 实验总结 研究内容 研究背景及意义 02 03 01 一、研究背景及意义 研究背景：脂肪酶是一种酯键水解酶，该酶可以在油-水界面上将甘油三酯催化水解或醇解生成脂肪酸和甘油。在许多行业领域脂肪酶都有及其广泛的应用，例如绿色生物能源、食品、医药卫生、洗涤、皮革制造、造纸等。近年来，国内对脂肪酶的需求往往供不应求，市场的需求与生产的严重脱节，使得这一研究迫在眉睫，又由于脂肪酶产量相对较低、种类少和主要依靠进口等缺陷，所以筛选和诱变培育获得高优势菌株为今后脂肪酶用于科学研究和工业生产具有重要的指导意义。 意义：通过对微生物高产脂肪酶菌株的筛选分离以及培养研究，不仅仅增加了生物多样性研究的基本内容，而且对于解决日益严重的废弃油脂问题同样具有指导意义，同时可以促进绿色能源的开发，例如生物柴油等，可谓一举多得。 二、研究内容 （一）产脂肪酶丝状真菌的分离及鉴定 初步筛选 样品初处理及富集培养 样品采集 菌株形态观察及分子生物学鉴定 脂肪酶活力测定 摇瓶发酵 1、产脂肪酶丝状真菌的分离 取样：从济南周边富含油脂的地区采取30份土样 制备土壤悬液：称取土样5克，迅速倒入带玻璃珠的无菌水(45mL)瓶中，震荡5-10分钟，静止后加入到富集培养基中培养48h 初筛：使用梯度稀释法将富集培养液用无菌水稀释至原溶液的10-3-10-9倍，取50μL分别涂布于油脂同化平板上，设置三个平行试验，30℃条件下培养3d。挑选其中变色圈的菌落，经划线分离培养单菌落。通过测定变色圈的大小，初步估计菌株产酶量及产酶活力。 2、菌株的形态学鉴定 将分离的菌株接种于查氏培养基上，30℃下培养，观察菌株生长情况，并记录。将生长良好的菌株置于显微镜下观察并记录。 菌丝有隔； 孢子为分生孢子； 未见有性孢子、孢子囊和子囊壳等组织，未见特化的细胞和组织体。 基内菌丝为白色； 孢子丝呈绿色； 产色素； 菌落表面干粉状，无皱褶，边缘整齐。 由此可初步鉴定SD-3菌株为曲霉科青霉属。 15×40 3、菌株的分子生物学鉴定 丝状真菌的18S rDNA序列具有高度的保守性，因此我们通过扩增18S rDNA序列来鉴定菌株。 18S rDNA 基因序列只能将菌株鉴定到属，因此仍需要其他保守序列的鉴定。例如克隆IS序列来对菌株进行鉴定。 18SrDNA序列的克隆 根据参考文献中扩增丝状真菌的18S rDNA通用引物序列来扩增青霉SD-3的18S rDNA基因。引物编号EF3和EF4，序列如下： EF3： 5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’ EF4： 5’-GGAAGGG[G/A]TGTATTTATTAG -3’ 以SD-3的染色体（30ng）为模板，EF3和EF4为引物进行18s rDNA 的PCR扩增，反应程序如下： 94℃ 4 min；94℃ 30s，48℃ 1min，72℃ 3min，35个循环；72℃ 30min；4℃ 存储。 从图中看出18S rDNA的PCR产物非常亮，而且条带单一，PCR扩增的特异性很强，几乎无杂带。 扩增产物大小约为600bp。回收扩增产物，与pGEM-T载体进行连接，然后挑选转化子送生物公司进行序列测定。 TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTT TATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTTACGCCCCCGGGCCCGCG CCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGTAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACT TTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTG CAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTC CGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATCCCGGG