动物细胞传代培养.ppt

动物细胞传代培养 实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理和方法。 实验用具：移液枪（每个台面一把），枪头（每个台面一盒），吸管（4根），培养皿（每组2个） 实验药品：0.125％胰酶，1640培养基 * * HeLa 是Henrietta Lacks的简称，Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。 * 细胞培养的基本概念 传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 * 细胞培养的类型 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。 * 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） * * 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒 * 消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 * 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染 * 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 * 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 * 血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分 * 抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 * 完全培养基的组成 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％（一般加10％） 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位／毫升 * 实验前的准备 培养基的配置 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％） * 消化液的配置 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D－hanks配置。 配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌 * 实验步骤 1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。 2．从冰箱中取出0.25％胰酶、培养基。可以把瓶盖打开或者拧松。 3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基。 4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动