第13章基因工程和基因组学.pptVIP

1971,美国史密斯,细菌,限制酶; 1972,伯格,限制酶分别酶切猿猴病毒DNA与λ噬菌体DNA,用DNA连接酶连接,新的DNA分子; 1973,科恩将重组外源DNA片段与质粒连接起来,重组质粒,转入大肠杆菌; 1974,异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达; 1982,基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进入市场; 1985,烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功; 1986,基因工程生物实验性地释放到环境中; 1990~1992,头一个转基因小麦,玉米; 1994,基因工程西红柿在美国上市; 1996,克隆羊多利诞生. 现在,利用基因工程技术创建新的生命形态,生产药品,疫苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病. 在基因工程实验中，载体作为一种运载工具通常用于装载外源的DNA片段或者基因，并将它转入受体细胞，使外源片段DNA分子能够在受体的细胞中进行繁殖，这种特殊的DNA分子称为基因克隆载体。 基因克隆载体必备的一些基本条件： （1）1个或多个克隆位点。 （2）携带外源的DNA片段（基因）进入到宿主细胞中能够进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。 （3）载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。 （4）载体必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因，对于细胞的生长不会产生显著的影响。 一、基因工程载体种类 通常包括质粒载体、噬菌体载体（包括噬菌体和质粒为基础构建的Cosmid载体），人工染色体载体（YAC、BAC、PAC、TAC）等。 2、质粒载体的构建用于基因克隆的质粒载体应具有操作方便、易于检测、插入后能够稳定不丢失的优点。 质粒构建的几个原则： （1）质粒载体具有能自我复制的元件，这也是所有克隆载体必需的。 （2）质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点，实际上在实际运用的载体上具有的多克隆位点数为一个。 （3）质粒载体上同时必须有可供筛选的抗生素标记：已经在质粒载体上使用的抗生素标记基因包括Ampr,Terr,Kanr等。 （4）构建的质粒载体应该足够小：由于质粒载体在进行遗传转化时，转化的效率与载体的大小有关。 四、人工染色体载体 1、人工染色体载体的种类 构建人工染色体必须满足几个基本的条件：必须具有行使正常染色体功能所必需的各种元件，主要是着丝粒、复制起点和端粒。 着丝粒是在细胞进行有丝分裂中期与纺锤丝微管相结合的部分，牵动染色体有规律地分配到子细胞中的部分。 端粒是保持染色体进行稳定性、染色体正常、精确地复制和维持染色体长度所必需的元件。 复制起点是所有生物进行DNA复制所必需的。 不同类型载体的克隆外源片段能力比较 第三节 植物基因组文库的构建 基因库(library):是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体植物基因组文库构建必须符合以下几个基本条件 （1）文库能够覆盖整个基因组 （2）插入的片段比较大：如插入的片段太小，基因组文库要求的克隆数目太多，不利于染色体的步移和组装。 （3）文库比较稳定，且容易保存和操作：外源的片段插入到载体以后片段本身不会丢失，并且片段之间不会发生重组现象。 植物基因组文库构建通常包括以下几个基本步骤 （1）大片段DNA克隆载体的准备 （2）大分子质量的植物基因组DNA制备。 （3）大片段DNA分子的部分酶切。 （4）载体与外源片段的连接。 （5）载体的遗传转化。 （6）克隆的挑取和验证及植物基因组文库的保存。 第四节 基因克隆的方法 模式植物：水稻、拟南芥、烟草 基因测序→基因功能→需要大量基因→基因克隆 基因克隆方法（几十种）：归纳为5大类 以已知序列为基础的基因克隆方法、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法、以人工突变体为基础的基因克隆方法、以表达差异为基础的 一、以已知序列为基础的基因克隆方法 1、以氨基酸序列为基础的基因克隆方法 （最为经典） 通过对表达的或者差异的蛋白质分子的序列进行测定分析以后，获得该蛋白质的一段氨基酸的序列。根据编码不同氨基酸的密码子设计出一条简并引物，利用这条RT-PCR或者进行RACE-PCR扩增的方法克隆基因的全长。 2、RACE-PCR与同源序列法扩增全长基因 RACE （rapid amplification of cDNA end）即快速扩增cDNA末端可分为以下几个步骤： A：mRNA反转录为一链的cDNA B：利用5’ cDNA的帽子结构设计出的引物分别与基因的特殊引物进行PCR嵌套扩增得一条或者几条特异的PCR带型 C：分别将这些带型克隆到质粒载体上进行PCR测序，通过分析和比较以后可以获得待克隆基因的3’端的片段。 二、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法 A：首先通过遗传分析将目的基因定位在染色体的一定区间内，或者说在目的基因的