固相析出分离法.ppt

固相析出分离法 药物化学 苏元元 目的： 浓缩； 初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 第一节 盐析法 第二节 有机溶剂沉淀法 第三节 其它沉淀方法 第四节 结晶 第一节 盐析法 一、基本原理 二、影响因素 三、盐析操作 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 （1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好， （4）不易引起蛋白质变性。 三、盐析操作 硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。 盐析用盐量的表征--饱和度： 饱和度（Saturation）的概念： 以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和浓度是767g/L定义为100%饱和度 目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。 对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mg／L，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 盐析方法： 1）分步盐析法(不同的盐浓度) 2）重复盐析法 高蛋白质浓度下共沉淀→重复盐析提高纯度 3）反抽提法(相同盐浓度) 第二节 有机溶剂沉淀法 一、基本原理 二、影响沉淀效果的因素 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。 优点： 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 2）溶剂易除去 3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点： 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 2）操作要求在低温下进行。 3）成本高，需防火防爆 总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。 一、基本原理 1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 脱水作用比静电作用强 严格控制低温 有机溶剂与水混合时产生放热反应 预冷（有机溶剂-10℃以下，蛋白质0℃左右）， 在冰盐浴中进行， 加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓变性，并散热。 温度影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 举例：固体发酵生产α-淀粉酶的提取工艺研究 α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液  加乙醇（70%）搅拌 α-淀粉酶↓ * pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 ~ 6.0 * 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T℃