组织学技术2011.05.14.pptVIP

宁夏医科大学组胚（研究生课程） 组织学技术与方法 指导教师：沈新生 　　　　　常 青 组织学与胚胎学的研究技术 组织学切片标本制作技术简介 制作光镜组织学标本最常用的方法是石蜡包埋切片法,即用石蜡把组织块包起来，使组织变硬，便于切薄。其主要步骤如下： 1.取材、固定  取材一般在动物死后2小时以内取。将取下的新鲜的组织块迅速投入固定液中进行固定。固定液的种类很多，常用的有：福尔马林、酒精、丙酮及一些混合固定液。固定的目的在于使组织中的蛋白质迅速凝固，以停止其死亡前的变化，从而保持标本的结构接近于其生前的正常状态。 2.脱水、透明、浸蜡 固定后的组织用水冲洗后，组织中充满水分，妨碍石蜡的侵入，必须用不同浓度的酒精将组织中的水分脱净，这一过程称为脱水。脱水后组织中含有酒精，仍不能与石蜡相融，要用二甲苯或氯仿替代酒精，组织经过二甲苯后呈现透明状态，这一过程称为透明。把透明后的组织块投入融化的石蜡中浸润，使组织内的空隙充满石蜡，产生一定的硬度，这叫浸蜡。 一、组织标本的取材 1. 来源： 组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡2h以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸检标本中，抗原显示仍较好。 取材的先后：应根据动物死后组织结构改变的速度的快慢而定。首先打开腹腔，取出消化管，因为消化管在血液循环停止后，黏膜很快发生自溶现象；其次为肝脏、脾脏等多血器官及神经组织；再其次才是其他脏器。 取材的大小：切取的组织块应小而薄，大小一般以2cm×1.5cm×0.3cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。 取材时要注明取材时间、组织名称、固定液名称、组织块数量，以备查。 2.各种因素对组织标本的取材的影响 如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位必须是主要病变区；③必须取病灶与正常组织交界区；④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。 3.取材后的处理 为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于 -196℃液氮罐内或-80℃冰箱内备用。 二、细胞和组织的固定 　 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。 （一）、固定剂 1．醛类固定剂（单纯固定剂）双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 （1）10%钙-福尔马林液 （40%甲醛10ml，饱和碳酸钙水溶液90ml）。 （2）10%中性缓冲福尔马林液 （40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）。 （3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液 (pH7.4) （多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4 500ml，两者混 　　 合加热至60℃，搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止，冷 却后加PBS液至总量1000ml）。 　2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 　（1）Clarke氏改良剂（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定。 （2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。 　　Danos（1976）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的细胞固定液。 （3）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，40%甲醛10ml。 　　 （4）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存备用。 　　 以上两种固定液适宜糖原，某些抗原，癌基因