重组干扰素课件.pptx

;;;;干扰素的作用机制;;关于乙肝;干扰素的分类及应用;;资金来源多样化;;;;;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;;;PEG分子量;1989-1999年，多亚型人天然干扰素混合物——IFNα-N3 和IFNα-N1 获批上市。由于人天然干扰素因其产量低、活性低且具有潜在的血源性病毒污染等特点而逐渐退出市场。 1987年，Amgen公司生产的复合干扰素产品Infergen（重组集成干扰素α注射液）获批上市，主要用于成年患者的慢性丙型肝炎治疗，不过其市场表现平平。 1990年，InterMune公司上市了第一个rh IFN-γ产品Actimmune，用于慢性肉芽肿病，重度恶性骨骼石化症等疾病的治疗。 1993年，Bayer公司上市第一个rh IFN-β1b产品Betaseron，用于多发性硬化症（MS）的治疗。 2001年，FDA批准Schering Plough公司的长效干扰素——聚乙二醇IFN-α 2b，使得给药频率减少为1周1次。 2014年7月和8月，Biogen Idec公司的长效IFN-β 1a产品Plegridy（聚乙二醇干扰素β-1a）获欧盟和FDA批准上市，用于治疗成人多发性硬化症（MS），其剂量为每两周一次。;;;第二大重组蛋白;五巨头垄断全球干扰素市场;受新型竞争药物冲击;疾病谱差异导致国外IFN-β国内IFN-α;疾病谱差异导致国外IFN-β国内IFN-α;国内干扰素新药的研发情况; 取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶活化培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。; 接种：接入30L种子罐，接种量10% 培养：30℃，pH7.0 控制：级联调节通气量和搅拌转速 DO为30%，3～4h，OD4.0 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。; 接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量 10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。 前4h：30℃，pH7.0，DO为30% 4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h 终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快 速降温至15℃以下 检测：发酵液杂菌检查; 连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、 质粒结构一致性、质粒稳定性。; 种子培养基：C/N比较低的培养基 发??培养基：C/N比较高的培养基 pH控制：加入缓冲体系; DO：高时，产物明显提高；同时质粒的稳定性提高 策略：加大转速，增加通气量，必要时用纯氧; 温度：要考虑菌体生长和产物的积累 策略：前期控制在30℃，保证菌体快速生长，后期控制在 20℃积累产物，同时防止产物降解; 菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养 ; 裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA、DTDE、PMSF 破碎-20℃菌体：2厘米 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。; 加絮凝剂聚乙烯亚胺：2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片 进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液：2℃～10℃,搅拌，对菌体碎 片、DNA等进行沉淀。 离心： 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。; 盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。;1、溶解粗干扰素 ;2、沉淀与疏水层析 ;2、沉淀与疏水层析;3、阴离子交换层析与浓缩;4、阳离子交换层析与浓缩;5、凝胶过滤层析;6、无菌过滤分装;7、检测项目