仪器03-分子荧光和磷光光谱.ppt

影响荧光的外部效应 5.溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭:荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。(浓度限量1?g ~ 1mg/ml) 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。 仪器 Instruments 仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯 利用汞蒸气放电发光的 光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线 以365 nm 的谱线最强 应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm 很强的连续光源 同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(??)和固定能量差及可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 合适的??可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但??15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； ??60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 紫外-可见分光光度计 荧光分光光度计 光路 光源 仪器 校正 吸收池 入射光与吸收光同方向 入射光与荧光垂直方向 两种光源(紫外+可见) 一种光源(紫外) 空白溶液(F=0) 荧光对照品溶液 (F=100%或50%) 空白溶液(T=100%) 紫外无吸收 两面透光 低荧光材料 四面透光 荧光分析方法与应用 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1?g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 定量依据与方法 (1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If = ? Ia 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10-? l c ) If = ? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 ? I0 ? l c = Kc 定量依据与方法 （2）定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较； 多组分混合物的荧光分析 (1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 可分别在各自的?荧波长处测定,求出它们的含量 (2) 如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光; 可选用不同的激发光进行测定 多组分混合物的荧光分析 激发光谱和发射光谱都互相干扰 利用荧光强度的加和性（If=If1+If2+If3+…），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解 例：硫胺荧 CT ?ex =385nm ?em=435nm 吡啶硫胺荧CP ?ex =410nm ?em=480nm 相互干扰荧 光光谱重叠 在385nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度, 或410nm下激发在435和480nm下分别测荧光强度, * 在385nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度 If =Kc——K: 纯物质在选定波长下测If,求K 或410 nm激发，在435和480nm下分别测荧光强度 If 435/385=26339?104cT+210 ?104cP If 480/385=9685?104cT+1022 ?104cP If 480/410=2816?104cT+1709 ?104cP If 435/410=6419?104cT+252 ?104cP 硫胺荧浓度 吡啶硫