实验十 植物DNA抽提.pptx

实验10、植物DNA的抽提和酶切;掌握植物总DNA的抽提方法和原理;植物DNA提取主要方法：SDS法、CTAB法;四、仪器设备;六、试剂;水稻基因组DNA的微量抽提;将水稻叶片约0.1~0.2 g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉状；将粉末倒入2ml离心管中。注意：动作迅速，不要让粉末解冻。 加入0.8毫升在65℃水浴中预热的抽提缓冲液，混匀，放入65℃水浴中保温20~30分钟 (期间每隔5分钟轻轻摇动一次离心管)。 加入0.8 ml氯仿:异戊醇:乙醇（76：4：20），混匀后，平放在振荡器上摇动10分钟（振荡频率以抽提液与氯仿完全混合为度）。 离心15分钟（12000 rpm、20℃），将上清液吸入一个新的2 ml离心管（记录体积）。 加入1/10体积的3M NaAc和等体积的冷异丙醇，轻轻混匀，静置5 min。 12000 rpm离心5 min收集沉淀。弃上清，用0.5 ml 70%乙醇洗沉淀两次，每次12000 rpm离心5 min。弃乙醇后短暂离心用移液器除去乙醇后于热板上（45 ℃ ）干燥1 min。 加入100 ul 1×TE溶解沉淀，并与65℃下保温10 min，期间混匀几次。加5 ?l 10 mg/ml 的RNaseA，37度消化1小时，之后直接纯化或于-20℃冰箱保存。 ;合并所提DNA，调整体积到300ul，然后加入等体积的酚/氯仿，充分轻柔上下翻转混匀10分钟，之后于12000rpm离心10min。吸取上清到另一支1.5mL离心管，加入等体积氯仿抽提10分钟，之后于12000rpm离心10min （4度） 。 吸取上清到另一支1.5mL离心管，再加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍上清体积的预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱中15min，取出后12000rpm离心10min（4度）。 去尽酒精，用500μL 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min（4度） 。 去尽酒精，风干，溶解于20μL-30uL 1×TE（可先在热板上预热到65 ℃）中。 电泳检测，取1ul DNA稀释10倍，之后取1ul 稀释的DNA配制点样体系：1μL DNA＋8μL dH2O＋1μL 10×loading buffer。用未酶切的λ DNA作为DNA分子量标记和定量marker。 注：氯仿抽提时，要保证抽提液中有一定的盐溶液，否则DNA进入沉淀。;在氯仿中加入0.3%乙醇可以消除挥发在空气中的毒性。 氯仿毒性主要体现在两个方面： （1）本身是有毒的，其蒸汽挥发到空气中造成污染； （2）在光照下会和氧气缓慢反应，产生毒性更大的气体—光气。 所??，氯仿在成品售出前，首先要用深色玻璃瓶封装，防止产生光气；其次要加入少量的乙醇，乙醇会和光气反应生成无毒的碳酸二乙酯。另外，乙醇等无毒物质覆盖在氯仿的液面上还能防止氯仿本身的挥发。;水稻基因组DNA的酶切;;思考题;水稻基因组DNA及酶切;DNA降解;03-8-17-DNA-1