分子实验14蛋白质纯化.doc

蛋白质纯化 一、亲和层析 1、绪论 亲和层析是基于待分离物质，如蛋白质、多肽、糖蛋白和核酸等生物分子，与固定化在载体上的配基分子之间的专一性相互作用的一种色谱学方法。通常是在载体（无机或有机介质）表面先键合一段间隔臂，再连接上配基。间隔臂的作用是减少待纯化蛋白质（或其他生物大分子）与其相适应配基结合时的空间位阻。这种固相化的配基将只能与其有生物特异亲和性的蛋白质分子相互作用而吸附，没有这种作用的其他生物分子不被吸附而流出层析柱，然后，改变流动相条件将吸附的蛋白质洗脱下来，于是达到分离纯化的目的。 材料 AKTATM 层析仪，电脑，分部收集器 缓冲液贮槽 层析柱、HiTrap chelating HP 1ml和5ml 偶联试剂，Ni2+ 洗柱缓冲液1M NaOH 纯化缓冲液 Binding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 5mM imidazole 6M guanidine hydrochloride, 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0 Washing Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole 6M urea 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0 Refolding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0 Elution Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl,500mM imidazole 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0 洗Ni缓冲液：20mM Sodium phosphate, 0.5M NaCl, 0.05M EDTA pH7.4 3、操作步骤（以纯化N-terminal (His)6-tagged recombinant protein produced in E. Coli为例 亲和层析柱连AKTATM层析仪 用5-10柱体积的去离子水走柱，去除保存在柱子中的20%的酒精 走0.1M NiSO4入柱，至层析柱变蓝 走10柱体积的去离子水平衡层析柱 用Binding Buffer平衡层析柱 纯化： 将已准备好的样用AKTATM层析仪进柱 用10柱体积的Binding Buffer平衡柱子 走10柱体积的Washing Buffer 复性：走线性梯度，共30柱体积，Washing Buffer 0%→Refolding Buffer 100% 用Elution Buffer 将目的蛋白洗脱下来，并收集样品 层析柱的再生和保存： 走10柱体积的去离子水去除层析柱中的Buffer 走10柱体积的洗NiBuffer洗掉Ni离子 用10柱体积的去离子水平衡 走1M NaOH入层析柱，并浸泡2h，去除层析柱中沉积的蛋白和其它杂质 走10柱体积的去离子水和PH为7.0的缓冲液平衡层析柱，直到层析柱中性为止。 用20%的乙醇保存层析柱 讨论 在亲和层析中常出现的一些问题以及解决方法 注意任何时都不得使层析柱流干或进气泡，并且不要超过树脂所能承受的压力。 避免偶联试剂，缓冲液和乙醇三者混合在一起，易产生沉淀，可用NaOH浸泡的方法去除。 一般5-10次纯化后才用NaOH彻底清洗层析柱。 所有上柱的样品和缓冲液都须过0.2uM滤膜，防止堵塞。 二、凝胶过滤层析 1、概述 凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析。 原理：凝胶过滤层析是再装填有多孔性材料的色谱柱中进行的，是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果。凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分子量蛋白质更早地被洗脱下来。最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此他们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以进入所有填料得孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。 2、材料 1、 2、 3、 凝胶过滤层析柱 装柱配套用具或凝胶储槽 缓冲液储槽 AKTA 电脑 分部收集器 3、步骤 1．如果凝胶过滤的介质是干粉，则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。切勿用磁力搅拌器搅拌。让凝胶颗粒自然降。对预溶胀的凝胶，先用大量缓冲液洗去防腐剂，重悬于等体积的凝胶缓冲液，倾入细颈过滤瓶中，在使用前