第二节 生物样品的预处理.pdf

来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少。 生化分离基本步骤 ㈠、选材（预处理） 将目的物从材料中以溶解状态释放 出来，方法与存在部位及状态有关。 ㈡、 提取 核心操作，须据目的物的理化 性质，生物学性质及具体条件 定。 ㈢、分离纯化 ㈣、浓缩、结晶、干燥 * 整个过程应有快速灵敏准确的分 析方法来衡量效果（收率、纯度） ㈤、 保存 第二章 生物样品的预处理 第二章 生物样品的预处理 第一节 样品分离的预提取过程 生物样品中往往含有大量有机物、无 机物及各种微量元素等，因此对目标组分 进行初步富集和分离，对干扰组分进行初 步去除等工作都属于预处理。 种类： 植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液 乳液和动植物组织提取液等。 特征： ⑴ 目标产物浓度普遍较低，悬浮液大部分是“水”，组 分复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、 脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物； ⑵分离过程很容易发生失活现象，pH 、离子强度、温 度等变化常常造成产物的失活； ⑶性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生 物污染，蛋白水解作用等。 1.植物组织中活性物质的提取 1.1 酶的提取 植物组织中所存在的酚类化合物使植 物中提取酶的过程变得复杂。 植物组织被破坏时，酶和酚类处混合 接触状态，很易发生反应。产物苯醌和单 宁酸类会继续和酶蛋白反应, 使目的酶失 去活性。为此去除酚类化合物或避免反应 是必须进行的步骤。 1.1.1预处理需要注意的条件： 1.1.1预处理需要注意的条件： ⑴ 温度尽可能低； ⑵提取液的量要保证“充分浸入”； ⑶加入足量酚类吸附剂； ⑷加入足量氧化酶抑制剂； ⑸ 搅拌转速要恰当； ⑹ pH要控制在合适范围，一般5.5～7。 1.1.2 酚类吸附剂的种类： 1.1.2 酚类吸附剂的种类： 很多天然和合成的聚合物可以用于吸附酚类 物质，如清蛋白、尼龙粉、聚乙烯吡咯烷酮-可溶 的（PVP ）和聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的 （PVPP ），相关地还有聚丙乙烯和聚丙烯树脂， 如离子交换树脂XAD-2 、-4和-7，基于聚苯乙烯 的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂（Bio-Rad AG1-X8,AG2-X8和Dowex-1 ）和阳离子交换树脂 （Dowex-50 ）。 1.1.3 氧化酶抑制剂的种类 1.1.3 氧化酶抑制剂的种类 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓 糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，而抗坏血酸盐则 较少使用。 前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清 除剂； 抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消 耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用 （50mmol/L ）。 1.2 RNA 的提取 从植物组织中提取RNA是进行植物分 子生物学方面研究的必要前提。 能否有效地去除多糖、酚类化合物、 RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物 是提取高质量植物RNA成败的关键 。 1.2.1 酚类化合物的干扰及对策 1.2.1 酚类化合物的干扰及对策 一、防止酚类化合物被氧化的方法 ⑴ 还原剂法 2-巯基乙醇(BME) 、二硫苏糖醇（DTT ）或cys 来 防止酚类物质被氧化 ,硼氢化钠（NaBH4 ）是可还原醌 的还原剂 ⑵ 螯合剂法 PVP和PVPP 中的CO －N ＝基有很强的结合多酚化 合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基 数量的增加而加强 ⑶ Tris-硼酸法