反向遗传技术在口蹄疫病毒基因组结构与功能研究中的应用.pdf

反向遗传技术在口蹄疫病毒基因组结构和功能研究中 的应用 张亚科，高学军 东北农业大学动物医学院，哈尔滨（150030 ） E-mail ：yakezhan 摘 要：反向遗传技术已广泛应用于 RNA病毒的基因组结构和功能的研究。本文综述了反向 遗传技术的研究进展,并讨论它在口蹄疫病毒研究中的应用。 关键词：反向遗传技术，口蹄疫病毒，基因组结构和功能 1. 引言 口蹄疫病毒( Foot-and-mouth disease virus ,FMDV) 引发的偶蹄动物口蹄疫是一种急性、 热性、高度接触感染的传染病, 该病被世界动物组织(OIE) 列为1类传染病之首[1] 。自从1897 年德国学者证实FMD是由一种比细菌小的滤过性传染因子引起的，至今人类对该病毒的研 究有近百年的历史，虽取得一定进展，但仍无法有效控制口蹄疫在全球的肆虐。 FMDV分为O、A 、C、SAT1、SAT2、SAT3 和Asial七个血清型，型间无交叉保护反应 [2 ] 。该病毒基因组为单股正链RNA ，病毒粒子呈正二十面体的球形结构。衣壳由VP1 、VP2 、VP3和VP4各60个分子组成，RNA分子位于衣壳内，约有8500个核苷酸（nt ）。基因组的5’ 端共价连接一种特殊的小蛋白 VPg （3B ），紧接着是约1300 nts的5’非编码区，依次是S片段 、聚胞嘧啶区[Poly(C)]和内部核糖体进入位点（IRES ）。3’端带有Poly （A ）尾，其上游约100 nt是3’非编码区。基因组中部是一大的开放阅读框，编码病毒多聚蛋白。多聚蛋白经3级裂 解后，形成3~4种结构蛋白（VP0或VP4 ，VP2 ，VP3 ，VP1 ）和8~9种非结构蛋白（Lab ， Lb ，2A ，2B ，2C ，3A，3B，3C和3D[3] ）。本文从病毒拯救技术，基因组结构和功能的研究 等方面，对国内外FMDV反向遗传现状作一综述，并分析该领域存在的问题和未来研究方向 。 2. FMDV 拯救系统概述 2.1 反向遗传系统概述 反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA 病毒的分子生物学研究提供 了一种强大的工具。自1978年第一例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类RNA病毒的分 子生物学研究取得了长足的进展,这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展。 该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子，通 过体外转录过程再次得到病毒RNA ，然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞拯救活病毒。 由于这种被拯救的病毒来自全长cDNA分子, 因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种 修饰或改造, 然后通过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果,从而达到对病毒因 组表达调控机制,病毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株，开发新 型疫苗。目前利用该技术已成功获得脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、 猪瘟病毒、烟草花叶病毒、芜菁黄色花叶病毒、登革病毒等的感染性分子克隆。 这种技术在正链RNA 病毒研究领域中已经发展到高潮，为研究病毒基因组结构和功能、 致病机制和病毒宿主细胞之间相互作用提供了技术平台[4，5] 。目前，拯救FMDV 主要运用两 -1- 个系统。 2.2 体外转录拯救系统 体外转录技术是利用外源RNA聚合酶在体外将基因组cDNA拷贝转录成基因组RNA ，由 于正链RNA病毒基因组本身具有感染性，所以用基因组RNA去转染细胞就有可能产生病毒 粒子.体外转录要求先在基因组cDNA拷贝两个末端进行修饰，5端添加一段外源启动子的核 心序列，其目的使RNA聚合酶在体外正确起始，3端需要有一段终止子序列或者类似的终止 结构，使RNA聚合酶在合成全基因组RNA后可以正确被终止. 影响