实验二 细菌培养及代谢产物检查.doc

实验二 细菌培养与代谢产物检查 【目的】 ①学习并初步掌握基础培养基制备方法。 ②了解细菌生长繁殖所需要营养以及常用培养基的种类和用途。 ③了解细菌所具有的不同生化反应及代谢产物，以利细菌的鉴定和鉴别。 ④规范地进行无菌操作。 一、基础培养基的制备 (一)培养基的制作程序 培养基制作的一般程序：准确称量培养基的各种成分→混合溶解→测定及矫正pH→分装、包装→灭菌→检定→保存备用。 (二)常用培养基的种类 按培养基的作用分为： ①基础培养基：含有细菌需要的最基本营养成分(蛋白胨1％0.3％0.5％)。按其性状不同可分为：(1)肉汤培养基。(2)普通琼脂培养基。分斜面和平板培养基，内含2～3％(3)半固体培养基，含0.2～0.5％ ②营养培养基：供营养要求较高的细菌用，如血琼脂培养基(在普通琼脂培养基中加入5％10％)。 ③选择培养基：如SS琼脂培养基，可选择性抑制非病原菌生长，有利于分离病原菌。 ④鉴别培养基：如含铁双糖培养基，用以鉴定细菌。 ⑤厌氧培养基：如庖肉培养基，用以培养厌氧菌。 (三)基础培养基的制备过程 1、肉汤(肉浸液)培养基 【材料】 牛肉、蛋白胨、氯化钠、水(蒸馏水或自来水)、NaOH溶液(1N和N／10)、0.02％酚红指示剂、吸管等。 【方法】 ①取新鲜瘦牛肉，除去脂肪及筋膜，切成小块后用绞肉机绞碎，每500g碎肉加水1000ml，混合置4℃冰箱过夜(使营养物质即溶解性蛋白质充分渗出)。 ②次日取出煮沸半小时左右，使肉渣蛋白质全部凝固；加热过程中不时地用玻璃棒搅拌，以免沉淀烧焦。也可不放置冰箱过夜，直接煮沸1小时。 ③用数层纱布过滤，弃去肉渣(肉渣中的液体应尽量挤净)，于滤液中加入1％蛋白胨及0.5％氯化钠，加热溶解，并补足失水至1000ml。 ④冷却到50℃在右，以N／10 NaOH调至pH值7.6～7.8。 ⑤待pH矫正后，再加热10min，使肉汤中部分蛋白质等因加碱及再度加热而凝固沉淀。过滤并补足失水，重复矫正pH值—次， ⑥将上述制备的肉汤分装于烧瓶或试管中，瓶口或管口加塞并包扎，经103.34kPa(15磅)20min高压灭菌后，置冰箱中或干燥阴凉处备用。 【用途】 用作基础培养基，其营养比肉膏汤好，一般营养要求不高的细菌均可生长。 2、肉膏汤培养基 牛肉膏系将牛肉汤加热浓缩而成，每1000毫升能浓缩成肉膏约70克。牛肉膏汤可代替牛肉汤来培养细菌，由于经长时间加热，部分营养成分(如糖分)已损失，故其营养价值略低于牛肉汤。但肉膏汤制作手续简单，制品透明清晰，酸碱度变化较小，故仍常用。 【材料】 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、氢氧化钠溶液、0.02％酚红指示剂、吸管等。 【方法】 ①将牛肉膏3～5g、蛋白胨10g、氯化钠5g加于1000ml水中，用玻棒搅拌使其溶解。必要时加热使其溶解。 ②矫正至pH7.4～7.6，煮沸3～5min，过滤。 ③分装于适当容器内，高压灭菌15磅20min，置冰箱中或干燥阴凉处备用。 【用途】供一般细菌培养用。 3、肉汤琼脂固体培养基 琼脂是海藻糖中提取出的一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用。加入培养基的目的是使之固态化，因其熔化点为100℃，凝固点约40℃，利用此特性，加至肉汤或肉膏汤内后，趁热可制得斜面，平板等不同类型的固体培养基，以供分离培养、繁殖细菌等用。 【材料】 pH7.6牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空试管、灭菌培养皿(9cm直径)。 【方法】 ①于pH 7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入2～3％琼脂，加热溶化。 ②以脱脂棉过滤去除杂质(或不过滤)，分装烧瓶或试管(琼脂斜面每管5m1)。 ③经15磅20min高压灭菌后，趁热将装有5ml肉汤琼脂之试管斜置，待冷凝后即成琼脂斜面培养基。高层琼脂的分装量约为试管长度的1／4或1／3；若接种厌氧菌则应为试管长度的2／3。烧瓶中肉汤琼脂冷至50～60℃时，以无菌操作法将其倾入灭菌空培养皿中(每皿15～20ml)，迅速盖上皿盖，并将培养皿于桌面轻轻回转摇动，使皿内培养基平铺皿底，待冷凝后即成琼脂平板培养基。 【用途】 ①琼脂斜面培养基用于纯种细菌接种以保存一般菌种。 ②琼脂平板培养基用于细菌的分离培养。 4、肉汤琼脂半固体培养基 【材料】 pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空小试管(10×100mm)。 【方法】 ①于pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，过滤并补足失水。 ②分装于小试管中，每管3ml，经15磅20min高压灭菌后直立冷凝即成。 【用途】 常用于细菌的动力检查和菌种保存。 5、干燥培养基 干燥培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾、真空、低温、蒸发等干燥方法，将培养基内水分去掉后形成各种固形成分，经过适当处理使成干燥粉末状。用时只要按一定比例加入一定