生物发光共振能量转移.docx

BRET 生物发光共振能量转移技术简介：生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作用动力学的研究。在应用这个系统研究感兴趣的蛋白前，首先需要将Rluc或者EYFP 融合到每个蛋白或者他们的辅蛋白上。在细胞中，融合蛋白共表达，然后和荧光素酶和其底物腔肠素反应，当能量供体Rluc，能量受体EYFP 之间距离比较近的时候(10-100?)，那么光将从Rluc(峰值480nm发射)传递到EYFP，形成它的激发，并且发射一个波长在530nm 的发射光，BRET 量化的程度以发射光530nm 和480nm 的比率表示。实验流程1、用于BRET的表达质粒构建；2、融合蛋白表达检测；3、BRET实验；4、实验结果分析及提交实验报告客户提供1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆）2、用于实验细胞（如果我公司细胞库有可不需提供）公司提供详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。服务周期和价格具体咨询本公司荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移-FRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer）指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。?（1）FRET发生条件：?? ?能量匹配：供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（30%）；?? ?作用距离：供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm；?? ?FRET效率公式：用于计算分子/基团间作用距离R??? ?偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。（2）FRET的应用：通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息（作用距离、作用方向、能量传递效率）。常用于解决如下问题：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合体；转录机制；转化途径；分子运动；蛋白折叠等生物学问题。（3）FRET常见的供体-受体荧光分子对：荧光蛋白类：????????????????????????????????????????????????????????染料类：FRET检测HIV附属蛋白与细胞膜CD分子相互作用摘自：A Flow Cytometry-Based FRET Assay to Identify and Analyse Protein-Protein Interactions in Living CellsCarina Banning, Jo¨ rgVotteler, et al.?图释：流式细胞仪FACSAria检测FRET信号。（a）活的293T细胞分别单独转入CFP、YFP、CFP/YFP 、CFP/YFP融合蛋白作为对照，确定最好的圈门方式为CFP/FRET。（b）293T细胞经过2%PFA处理后，YFP荧光强度出现明显下降。筛选有相互作用的未知蛋白质的流程?图释：流式细胞仪FACSAria进行FACS-FRET高通量筛选感兴趣蛋白相互作用的未知蛋白。（a）FACS-FRET筛选流程。（b）在活的293T细胞中转入Vpu-YFP作为诱饵，与等量的CFP融合蛋白（蛋白的cDNA库）相互作用36小时后，分选FERT+细胞。?FRET研究蛋白酶功能摘自：Detection of Infective Poliovirus by a Simple, Rapid, and Sensitive Flow Cytometry Method Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer TechnologyJason L. Cantera? et al. Applied and environmental? microbiology, Jan. 2010, p. 584-588?图释：流式细胞仪FACSAria检测脊髓灰质炎病毒（PV1）10倍感染BGM-PV细胞，8小时后上机检测。A~C病毒浓度分别为0.4~0.004，D为阴性对照。双分子荧光互补技术BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation）是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段，分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。活细胞收集后，在流式细胞仪中的检测是实时进行的，只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号，因此，不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。?双分子荧光互补技术原理示意图(a) 诱饵和