凝血酶蛋白的稀土特异性标记及绝对定量.doc

凝血酶蛋白的稀土特异性标记与绝对定量 摘 要：采用夹心法，用稀土离子标签标记凝血酶蛋白进行定量分析。通过选择合适的适配子，将MMF-DOTA-La标签接到适配子上,另选一种适配子接上包覆BSA的磁性纳米粒子。血清中，两种适配子特异性的选择结合到目标凝血酶蛋白上。磁性纳米粒子可以实现目标蛋白在磁场中快速分离,热解除去纳米粒子，将目标物质用ICP-MS检测La离子浓度。实验发现，稀土标签具有很高的灵敏度，离子检测强度和目标蛋白浓度具有很好的线性相关。 关键词：稀土，凝血酶，适配子，夹心体 1背景介绍 1.1 凝血酶蛋白作用及定量方法 1.1.1凝血酶 凝血酶是一种多体络合酶，参与多种酶促反应和细胞反应，可以促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白，起到凝固血液作用。局部应用后作用于病灶表面的血液很快形成稳定的凝血块，用于控制毛细血管、静脉出血，或作为皮肤、组织移植物的黏合、固定剂。凝血酶对血液凝固系统的其他作用尚包括诱发血小板聚集及继发释放反应等。临床上，个体血液中凝血酶的含量是一项重要的生理指标，反映个体的自我止血能力，可以在手术中为医生提供参考。但是从目前的医学条件来看，尚无可以直接从病人体中检测凝血酶即时浓度的方法。一般的，通过检测血液中TAT （thrombin-antithrombin-complexes）的含量来间接的了解凝血酶的浓度，但是由于TAT的半衰期远远大于凝血酶半衰期，这个浓度值远不能反映凝血酶实时浓度。 传统凝血酶标记方法常见细胞抗原-抗体免疫实验，通过荧光探针检测法得到蛋白浓度，但这种方法操作复杂，而且存在光谱重叠，发色团不稳定，光漂白等问题。近年来出现以两种功能适配子结合凝血酶蛋白，然后分离，通过检测适配子中金纳米粒子浓度来分析凝血酶浓度的新方法。本实验提出一种以两种功能适配子为连接体，以稀土作为标签的检测凝血酶浓度的新方法。 1.1.2凝血酶的标记策略 1.1.2.1适配子 适配子是RNA分子或单链DNA分子,可以选择性的结合到各种目标分子上,如:蛋白质,核酸,细胞,小分子有机物等。利用SELEX技术从体外人工合成的单链随机寡核苷酸文库中经过多轮筛选和富集可获得能与靶分子高亲和力和高特异性结合的适配子。它的亲和力和特异性能与抗体媲美，甚至优于抗体，且具备抗体所不具备的一些优点，如核酸适配子的分子量小、制备简单、生产不依赖于动物、成本低、易重复、毒性低、无免疫源性等。 1.1.2.2 ICP-MS检测法 作为一种准确和高灵敏度的元素检测仪器，ICP-MS具有许多优异的特性，包括：大的浓度检测区间（9个数量级），不同蛋白质之间独立的检测信号，多元素同时检测和很高的元素分辨率。近年来，ICP-Ms开始用于蛋白质绝对定量，如应用最广泛的是对蛋白质中S，P，Se同位素的检测。然而由于些同位素自然丰度较低，导致离子化和多原子光谱效应较差，在ICP-MS中检测效果有限。最近，通过接入ICP-MS灵敏度高的元素标签来实现蛋白绝对定量成为一种可选策略。 1.1.2.3 凝血酶的绝对定量 凝血酶标记反应是一个高度灵敏性和专一性反应，反应中使用两种新型适配子来增大反应的专一性：其中稀土标记的 Apt29 与凝血酶上的肝磷脂位点结合，由于稀土标签和目标蛋白以1：1关系结合，所以可以利用它对目标蛋白进行绝对定量。包覆在磁性纳米粒子上的Apt15与凝血酶上的纤维蛋白原位点结合，磁性纳米粒子在磁场中便于分离，用于捕获目标蛋白,而且可以增大反应的速率，每粒磁性粉大概可以结合1400000个Apt15。 将制备的夹心体在磁场下分离,将分离物加热至90℃，这时Apt15 连接蛋白的键断开，apt15脱离产物。在磁场作用下分离除去Apt15-magnetic beads，剩余稀土标签产物利用ICP-MS检测。通过做出标准工作曲线，然后比较待测样ICP-MS强度值最终得到凝血酶蛋白浓度。 1.2本课题的实验思路 以稀土元素标签的ICP-MS蛋白质检测法是近几年出现的一种新型检测策略，由于生物体中稀土元素含量极少，所以检测背景低，而且ICP-MS对稀土元素非常灵敏，可以实现多元素同时检测，稀土中包含17种元素，这使多蛋白同时标记成为可能。 首先，选择合适的适配子，并合成出磁性纳米粒子和稀土标签，对合成磁性纳米粒子条件进行了优化考察，包括反应温度、时间和溶剂量比对性能的影响，筛选出最佳反应条件，为后面的研究打下扎实的基础。 其次，在上述实验基础上，尝试凝血酶夹心体反应。通过适配子对肝磷酯位点和纤维蛋白原位点的特异性识别，把两种适配子分别加入血样中培养一段时间，然后利用磁性纳米粒子特性，在磁场中分离目标蛋白。 最后，重点研究了ICP-MS对稀土标签的检测。通过考察凝血酶浓度和稀土离子检测信号强度之间的线性关系,推测本检测手段的可行性 实验中，对合成磁性纳