11 第七章 环境内分泌干扰物.ppt

竞争性抑制与ELISA的原理图 本图示为酵母菌获得的性激素受体表达实验的过程，该原理类似于酵母双杂交体系。 E2：为雌二醇激素。 * 研究范例Leon E. Gray, Jr et al. / TOXICOLOGICAL SCIENCES 123(1), 206–216 (2011) Dose-Response Assessment of Fetal Testosterone Production and Gene Expression Levels in Rat Testes Following In Utero Exposure to DEHP, DIBP, DIHP,DINP * With the drug concentration increased, testosterone levels gradually decline. 研究范例Leon E. Gray, Jr et al. / TOXICOLOGICAL SCIENCES 123(1), 206–216 (2011) 研究范例Leon E. Gray, Jr et al. / TOXICOLOGICAL SCIENCES 123(1), 206–216 (2011) Insl3:胰岛素样因子3 StAR:类固醇激素合成急性调节蛋白 Cyp11A:细胞色素P450亚家族成员 四、环境内分泌干扰物筛检方法 （一）体内实验 1.动物喂养实验 2.啮齿动物切除卵巢后子宫肥大实验或动情期 实验 （二）体外实验 1.雌激素受体竞争性抑制法 2.标志基因鉴定 * 1.动物喂养实验 （一）体内实验 * EDCs 妊娠鼠 皮下注射 雄性子代 后代不育情况 成年后睾丸发育情况 生殖腺损害情况 通过测定EDCs对动物是否具有促进子宫生长的作用来评价其雌激素活性。 该种实验直接作用于雌激素效应器，可以直接显示化学物的类雌激素功能。 2.啮齿类动物切除卵巢后子宫肥大实验或动情期实验 * 动物实验的优缺点： 优点：1.最具真实性 2.最具说服力 缺点：1.实验过程繁琐 2.实验结果受动物年龄、性别、品系、个 体差别及取样误差等影响 3.对环境低浓度暴露不易获得正确结果 （一）体内实验 1.雌激素受体竞争性抑制法 基于ELISA的受体竞争结合法检测环境雌激素 方法：采用免疫测定介导受体竞争结合试验定量检测环境雌激素 将17β-雌二醇-BSA固定在微孔板上，环境雌激素与微孔板上的17β-雌二醇-BSA竞争性的与雌激素受体结合，与微孔板上17β-雌二醇-BSA结合的受体与雌激素受体的抗体、雌激素受体抗体的二抗形成一个三明治形式的复合物，通过显色剂显色，最后用比色法对试验结果进行定量。 结果：整个反应中环境雌激素浓度越高，溶液的吸光度值的变化就越小，环境雌激素的浓度与吸光度值成负相关。 （二）体外实验 * （1）酵菌转基因获得的性激素受体表达实验 主要检测雌激素受体结合依赖性转录和转录活性。 此法是用具有完整的人雌激素受体DNA的表达质粒和带有β-半乳糖苷酶结构基因上游的雌激素反应元件的标志质粒转化酵母菌—酿酒酵母菌形成激素依赖性转录活化因子，然后加入雌激素或待测的物质培养当雌性物质结合到受体上激活相应的激素反应元件合成β-半乳糖苷酶，利用酶-底物法检测其活性。 2.标志基因鉴定 人雌激素受体DNA β-半乳糖苷酶结构基因上游雌激素反应元件 待测物质 有颜色显示 无颜色显示 (2) 质粒载体转染法 构建含有由雌激素、雄激素或视黄酸应答的DNA加强元件的激素诱导控制下的莹虫酶基因的标志质粒载体，然后将这些载体短暂转染入含有相应受体的人类卵巢瘤BG-1细胞系中，显示它们同各自激素反应诱导莹虫酶的能力 。 2.标志基因鉴定 3.细胞增殖实验 人乳癌细胞（MCF-7）增殖实验 实验原理 MCF- 7：激素依赖性细胞系，加入雌激素后诱导细胞增殖。 实验结果判断 比较在加入10%血清后的培养液中，加或不加 E2 或类雌激素物质培养后的细胞数量。 研究实例 Harris 等利用此细胞系研究二噁英（TCDD）及其结构类似物对雌激素受体的影响，认为TCDD及TCDD类似物通过诱导CYP1A1基因表达而产生抗雌激素作用。 * 实验原理 卵黄黄素：卵生脊椎动物幼年期由肝脏合成的 雌激素依赖性蛋白前体，成年雌性体内含量极微或不能检出，但在 雌激素或类雌激素物质作用下可过度表达。 实验结果判断 检测VTG或其mRNA含 量即可判断该化合物有无雌激素活性或其作用强度。 应用价值 作为鱼、 蟾蜍、爬行动物等卵生动物的雌性激素的一种生物标