新生大鼠心肌细胞原代培养方法改进.pdf

第 31卷 ／第 2期 ／ 河北师范大学学报 ／8然科学版 ／ Vo1．31No。2 2007年 3月 JOURNALOFHEBEINORMALUNIVERSITY／NaturalScienceEdition／ Mar．2007 新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进 王 娜 ，一， 关 鹏 ， 段相林 ， 李 清 ， 常彦忠 ， 石振华 (1．河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050016；2．河北医科大学 基础课部，河北 石家庄 050091) 摘 要：探讨更为简单的SD大 鼠心肌细胞原代培养的方法，使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度，为 临床应用建立心肌细胞模型．取出生 24h内SD大 鼠的左心室。剪碎、消化、分离和纯化。进行培养 。0．1g／L胰酶消 化 ，可以分离到形态完整、贴壁生长的心肌细胞 ．进一步通过离心、差速贴壁和化学试剂抑制非心肌细胞生长 ，纯化 得到95％以上的心肌细胞．成功建立了心肌细胞体外培养模型，获得了高纯度的心肌细胞． 关键词 ：新生大 鼠；心肌细胞 ；原代培养 中圈分类号：Q813．11 文献标识码 ：A 文章编号：1000—5854(2007)02—0256—04 原代培养的心肌细胞具有 自发搏动性 、可控性好、重复性好等结构与功能特点[，是研究单一因素对心 肌细胞影响的理想模型，可在不受神经体液因素的影响下，对药物和其他因素的影响进行直接观察[2-3】。纯 化的心肌细胞均一性好，特别适用于生物化学方面的研究；可对作用于心脏 的新药进行筛选 ，并对其安全性 进行评价 ；能从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子 ；能利用心肌细胞进行建立胚胎干细胞条件培养基 的研究H J．总之 ，心肌细胞的原代培养技术越来越被人们所重视 。虽然已有心肌细胞培养方法的报道 ，但 存在细胞存活率低、纯度不高等缺陷．笔者实验室经过长期尝试，摸索出了简单并且稳定、可靠的培养心肌细 胞的方法． 1 材料与方法 1．1 实验动物和试剂 新生 24h内的SD大鼠 10～15只，DMEM培养基 (Invitrogen公司)，胎牛血清 (四季青公司)，胰蛋 白酶 (Gibco公司)，Brdu(Sigma公司)，a．SA(Sigma公司)，ABC免疫组化试剂盒 (Sigma公司)，DAB显色试剂盒 (武汉博士德公司)． 培养基 I：DMEM培养基 ，100g／LFBS，1g／L青一链霉素。 培养基 1I：DMEM培养基 ，0。1mmol／LBrdu，1g／L青-铝圭霉素。 培养基Ⅲ：DMEM 培养基 ． 1．2 方 法 】．2．1 细胞的制备和培养 在超净工作台中将新生大 鼠颈椎脱 臼处死，开胸取出左心室，用 PBS反复冲洗 ，以洗净残留积血 ．将心 室剪成 1mm0心肌组织块 J，用 1g／L的胰蛋 白酶在 37℃水浴消化 10min，弃上清液，再加入胰蛋 白酶液消 化 10min，将上清液转移到另一支无菌离心管中，并加入等体积的培养基 I终止消化。给沉淀的心肌组织块 再加入胰蛋白酶溶液反复消化，至心肌组织块完全消化为止．将心肌细胞悬液离心弃上清．沉淀物 中加入 1～2mL的培养基 I，用吸管轻轻吹打制成心肌细胞悬液 ，分装于六孔板中，置于培养箱 中培养 2h[．非心 肌细胞贴壁速度较快，首先贴壁，而心肌细胞仍处于悬浮状态，此时将心肌细胞悬液按实验要求的密度重新 接种于六孔板中．第 2天换培养基 Ⅱ培养 2d[8--9]，以抑制非心肌细胞增殖 ．换培养基Ⅲ培养，此时的细胞为 较纯的心肌细胞 ． 收稿 日期 ：2006—10—23；修 回 日期 ：2006—12—19 基金项目：河北省 自然科学基金 (303158)；河北师范大学博士基金 (B2002010) 作者简介 ：王 娜(1976一)。女 ，河北定州人 ，河北医科大学助教 ，河北师范大学硕士研究生，主要从事心血管疾病 的研究 通讯作者 ：石振华(1965一)，男，副教授 ，主要从事生物化学研究 ．E—mail：shizhhtom@ 126com · 257 · 1．2．2 心肌细胞质量评定