杂交瘤技术实验原理.ppt

杂交瘤技术制备单克隆抗体的实验原理 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞 一、杂交瘤技术产生的3个技术关键 1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性： B淋巴细胞(B lymphocytes)： 骨髓瘤细胞 (myeloma cells): 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。 经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。 2. 细胞融合技术： 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 长命 不分泌抗体 分泌抗体 短命 分泌抗体 长命 K?hler和Milstein, 1975 1984年Nobel医学奖 3. 杂交瘤细胞的筛选 ： 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾细胞/?脾细胞 骨髓瘤细胞/ ?骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞 脾细胞 筛选出 不能长期存活 不能长期存活 HAT培养基筛选 H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶 DNA 内源性途径(主要途径) 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 二氢叶酸还原酶 A H T 外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK- 存活 死亡 外源性途径(旁路途径) 二、杂交瘤技术的操作流程 1. 动物免疫： 目的： 在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞. 特定目标抗原 动物 免疫 脾脏中B淋巴细胞 B淋巴细胞大量增殖 刺激 能分泌针对于该抗原的特异性抗体 常规免疫法 脾内一次性免疫法 短程免疫法 体外免疫法 常用免疫方法： “稳妥；优势克隆” 皮下注射 腹腔注射 静脉注射 免疫途径： “省时；省抗原” “省时” “操作繁琐” 常规免疫法： 第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 第3次免疫：抗原+不加佐剂 第4次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) (皮下注射) (皮下注射) (静脉注射) 二、细胞融合及HAT筛选 病毒介导的细胞融合 PEG介导细胞融合 电激融合 1、细胞融合方法： 细胞悬液的制备与融合 (1) 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 (3) 细胞融合：50%PEG(1000~4000), pH8.0, 38oC, 1min 2、HAT培养基的筛选 融合后细胞混合液 HAT培养基 2 weeks later HT培养基 正常培养基 1 week later 三、抗体的检测 要求： 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品 常用方法： 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法 酶联免疫吸附法(ELISA) 抗原 第1抗体 酶 第2抗体 待检杂交瘤培养上清液 底物 有色产物 酶标仪检测 技术原理： 四、克隆化 常用克隆化方法： 有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法 80个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells) ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。 由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 单克隆抗体优点： 高度纯一 高度专一 应用： 疾病的论断和治疗(生物导弹) 生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 细胞器的鉴定、定位和分离 特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 常用的大规模培养方法： 动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养 获得大量单克隆抗体 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 B淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 杂交瘤技术操作流程图解 抗体纯化 洗脱液 支持物 被分离物