2017-01-15 酵母表达系统 陈凯.pptx

酵母表达系统 汇报人：陈凯 汇报时间：2017-01-15 ;主要内容 一、酵母表达系统的种类； 二、酵母的表达载体； 三、酿酒酵母表达系统； 四、毕赤酵母表达系统； 五、毕赤酵母表达系统中外源基因表达优化。; 酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。（可有性繁殖）;一、酵母表达系统的种类 1、酿酒酵母表达系统； 2、甲醇营养型酵母表达系统---巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母； 3、裂殖酵母表达系统； 4、乳酸克鲁维亚酵母表达系统； 5、 Arxula adeninivorams 。;二、酵母的表达载体 酵母表达载体依据其复制形式分为自主复制型和整合型两种。 1、游离质粒载体 指带有自主复制序列（ARS）的复制型质粒和带有酵母内源质粒2μ环的衍生质粒载体。 它细分为三种： ①酵母附加型质粒（YEp）----拷贝数高较稳定； ②酵母复制质粒（YRp）-----拷贝数高但不稳定； ③酵母着丝质粒（YCp）----每个细胞平均只有一个拷贝，稳定。;2、整合载体 整合载体（yeast integration plasmid ，YIp）指不含酵母自助复制序列，不能独立复制的载体，但含有整合介导区，可通过同源重组整合入酵母基因组并随同酵母染色体一起复制。;三、酿酒酵母表达系统 酿酒酵母是目前了解最完全的真核生物，1996年完成全基因组测序，是一种真核生物模式菌，被FDA认定为安全性生物。 1、常用的启动子 1）糖酵解途径中关键酶的启动子： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因 GAPDH、 磷酸甘油激酶基因 PGK、 乙醇脱氢酶基因 ADH； 2）半乳糖激酶启动子：GAL1； 3） pho4TS-PHO5启动子。 ;2、酿酒酵母分泌系统 1）信号肽结构： 2）常用分泌信号肽： ①性结合因子---MF-α； ②酸性磷酸酯酶---PHO5； ③蔗糖酶---SUC2； ④ 杀手毒素因子KIL。 3）信号肽特点： ①保守性低； ②大多异源宿主系统的信号肽不能互用；;4）MF-α信号肽： ①由88个AA组成； ②分泌效率高； ③在酵母系统具有通用性。;3、酿酒酵母糖基化系统 1）糖基化位点： Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） 2）糖基化类型： ①N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 ②O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化。 3）糖基化特点：过糖基化（超糖基化修饰）;4、酿酒酵母表达系统缺点： 1）对产物的翻译后修饰与高等真核生物不同，常发生超糖基化（N-糖基链上出现100个甘露糖，是正常的十几倍）； 2）不易进行高密度发酵，表达产物产量低； 3）分泌效率低，30KDa的蛋白几乎不分泌； 4）表达的蛋白C端易被截断；;四、巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，是80年代开发和研制的一种外源蛋白高效表达系统。 1、特点 ●含醇氧化酶基因（AOX）强启动子，用甲醇可严格调控外源基因的表达； ●外源蛋白基因遗传稳定； ●自身分泌的背景蛋白少； ●表达水平高，即可胞内表达又能胞外表达； ●具有翻译后修饰系统（糖基化、磷酸化、脂酰化）； ●使用简单，成本低廉； ●可高密度发酵，且发酵工艺成熟，易放大；;2、宿主细胞 目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌。 1）营养缺陷型菌株;2）蛋白酶缺陷型菌株;3、表达载体 由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体，故应用整合型载体，通过同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达。;胞内表达型载体;常用启动子;4、转化及筛选鉴定;（1）表达载体的线性化 未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，故需使用特定的限制性内切酶进行线性化处理。处理的目的： 1）防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活； 2）让同源重组以指定的方式发生。 ;（2）转化方式;（3）目的基因的整合方式 1）基因插入AOX1或aox1::AGR4位点;2）基因替换AOXI位点;3）基因插入HIS4位点;4）多拷贝插入;（4）筛选 1）组氨酸缺陷平板初筛 毕赤酵母菌GS115及KM117在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，因而不能合成组氨酸。转入的质粒含HIS4基因可与宿主互补，通过MD筛选培养基即可选择转化