绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株衣壳蛋白基因的克隆及表达.pdf

绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株衣壳蛋白基因的 克隆与表达1 1 1 1 2 斯日古楞 ，么宏强 ，马学恩 ，王升启 1 内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特（010018 ） 2 中国军事医学科学院，北京（100850 ） E-mail ：srgl66@126.com 摘 要：为了建立原核高效表达体系，从自然感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株的肺肿瘤组织中 提取基因组DNA ，应用PCR 技术分别扩增编码gag 基因衣壳蛋白（capsid protein ，CA ）基 因，通过T-A 克隆的方法分别克隆入pGEM-T Easy 载体中，然后利用设计的起始密码、终 止密码以及相应酶切位点的引物，把gag 基因的CA 蛋白基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1 中，构建CA 蛋白的重组表达质粒，经酶切、PCR 及DNA 测序鉴定后，将阳性质粒转化入 E.coli BL21 CodonPlus 中在IPTG 的诱导下表达，表达产物用SDS分析鉴定。结果表 明，该基因可以在大肠杆菌中以可溶性和包涵体形式高效表达，表达的CA 融合蛋白表观分 子量约为37KDa ，表达量占全菌蛋白的20% ，并利用谷胱甘肽Sepharose 4B 亲和层析柱纯 化可溶性表达蛋白得到的表达蛋白和从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度，是一 种理想的免疫原。本研究为下一步利用重组蛋白研制绵羊肺腺瘤病病毒内蒙毒株的单克隆抗 体及诊断试剂盒和基因工程疫苗等奠定基础。 关键词：绵羊肺腺瘤病，绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株，衣壳蛋白，基因克隆，表达 1. 引 言 绵羊肺腺瘤病毒（jaagsiekte sheep retrovirus ，JSRV ）是反转录病毒科β-反转录病毒属 (betaretroviruses)的成员之一，是引起绵羊肺腺瘤病（sheep pulmonary adenomatosis, SPA ）的 主要病原。SPA 是一种慢性、进 行性、接触传染性的肺脏肿瘤性疾病[1] [2] [3]。广泛分布于除澳大利亚、新西兰和冰岛 外，几乎所有养羊业发达的国家和地区[2] [3]，包括我国的新疆、内蒙古等地，严重影响着 世界范围内养羊业的发展。研究发现，JSRV 的 RNA 基因组为线性单股正链 RNA ，具有D 型致癌病毒（oncoviruses ）的遗传学结构特征 [4][5][6] 。病毒 RNA 编码区内有相互重叠的 gag、 pro 、 pol 、 env 基因的典型结构 [7] 。gag 基因的表达产物是编码 612 个氨基酸、分 子量约为 68KDa 的前体多肽蛋白。形成的前体蛋白经病毒编码的蛋白酶裂解后产生三种主 要的结构蛋白，分别为基质蛋白（MA ）、衣壳蛋白（CA ）、核衣壳蛋白（NC ）。衣壳蛋 白（CA ）是 JSRV 的主要核心蛋白，构成病毒粒子双层壳的内壳— 即衣壳，具有疏水性， 其氨基酸序列比较保守，它在病毒早期感染与脱衣壳过程中可以稳定未整合的前病毒 DNA [8][9],在感染晚期对病毒的装配和出芽发挥重要功能 [10] 。本研究采用 PCR 技术扩增本研 究采用 PCR 技术扩增 gag 基因的 CA 蛋白基因，实现了其在大肠杆菌中的表达，并对表达 的重组蛋白进行了有效纯化，现报告如下。 2. 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 绵羊肺腺瘤病羊肺肿瘤组织 1本课题得到国家自然科学基金（项目编号）和教育部高等学校博士学科点专项科研基金（项目 编号：20040129001 ）的资助。 - 1 - 取自内蒙古某羊场 JSRV-NM 株自然感染病例（经病理解剖、病肺组织切片和电镜负染 色技术观察鉴定）采集的肺脏，由内蒙古农业大学动物科学与医学学院绵羊肺腺瘤病分子发 病机理研究课题组保存。 2.1.2 菌株与质粒 E.coli DH5α( 克隆用) 、E.coli BL21CodonPlus （表达用）及pGEM-T