20_常用分子生物学技术的原理及其应用-郑芳.ppt

2.基因芯片工作流程示意图 Heatmap DNA microarray的原理 演示 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 二、蛋白质芯片 蛋白质分子间的亲和反应 1. 蛋白质芯片(protein chip) 2. 蛋白质芯片作用原理 Protein microarray的原理 演示 生物大分子相互作用研究技术 蛋白质相互作用研究技术 DNA蛋白质相互作用分析技术 5 PART ① ② The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 一、蛋白质相互作用研究技术 为什么研究蛋白质相互作用？ 研究蛋白质复合物 DNA的复制和转录 蛋白质的合成和分泌 信号转导和代谢 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 1. 亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 应用： 证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合 分析两种分子结合的具体结构部位 筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 2.酵母双杂交技术的基本原理和用途 利用酵母转录激活因子 GAL4的生物特性 DNA结合区（binding domain，BD） 促进转录的活性区（activation domain，AD） 基因表达激活 酵母双杂交技术的基本原理演示 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 为什么研究DNA和蛋白质相互作用？ 研究DNA-蛋白质复合物 基因表达的基础 研究基因表达调控的机制 研究对象 转录因子所结合的特定DNA序列 基因的调控序列所结合的蛋白质 Electrophoretic mobility shift assay，EMSA DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作 可以做定性和定量分析 是转录因子研究的经典方法。 研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。 1. 电泳迁移率变动测定 核心：蛋白质与DNA探针结合会增大其分子量 放射自显影 未结合探针 结合有蛋白的探针 标记探针 1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 未标记探针 10X 凝胶迁移实验结果示意图 Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP （二）染色质免疫沉淀法 是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法 1. 活细胞状态中固定DNA-蛋白质复合物 2. 随机切断为短染色体片段 3. 免疫学方法沉淀复合物 染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图 1.掌握印迹技术的原理、类别及用途；Southern、Western印迹技术的基本实验流程；探针的概念、种类与标记 2. 熟悉：Northern印迹法的基本实验流程及用途 3. 掌握：PCR技术的工作原理、基本反应步骤和主要用途； 4 逆转录PCR、原位PCR、实时PCR技术的原理及应用 大纲知识点要求： 5.掌握：基因文库的概念、种类及用途 6.了解：基因组DNA文库、cDNA文库构建的基本过程 7. 掌握：基因芯片的概念、工作的基本原理及用途；蛋白质芯片的概念、工作原理及用途 8.了解：基因芯片、蛋白质芯片的基本过程工作流程 9.掌握：标签蛋白沉淀、酵母双杂交的原理和用途；EMSA、ChIP的原理和用途； 大纲知识点要求： * * * * * * 4.3 DNA芯片技术 (DNA array) PCR技术的原理与应用 PCR工作原理 PCR技术的主要用途 2 PART ① ② The Principle and Application of PCR Technology 1.聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR) 一、PCR技术的工作原理 1983年 27岁年轻科学家 Mullis发明获得了1993年的诺贝尔奖 1969年Thomas D. Brock 报道了在黄石公园温泉中发现了一种新的细菌 Thermus aquaticus (Taq) 1971年 DNA polymerase 从T. aquaticus 分离出来，这种酶可以在75 ℃高温保持活性。 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Temp