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3沉淀反应、免疫电泳要点
原理 免疫比浊实验是在一定量的Ab中加入递增量的Ag ,反应一段时间后,形成可溶性免疫复合物,此复合物在PEG作用下,自液相析出,形成微粒,使检测浊度发生改变,用浊度计检测相应浊度,浊度高低与复合物含量成正比。绘制标准曲线,根据浊度推算样品中Ag含量。 用途: 定量测定,如测 IgG、IgA、IgM、C3等含量 三. 凝胶免疫电泳 (agar gel immunoelectrophoresis) 在电场作用下的凝胶扩散 电泳技术: 带电胶体颗粒在电场中向 相反电极泳动,利用电泳现象 研究某些化学组分的分离技术 免疫电泳技术的优点: 1.加快反应速度 2.规定了抗原、抗体扩散方向,提高反应敏感性 3.可将某些带电性不同的组分分开,再进行抗原抗体反应 影响电泳的因素: 1.与溶液的pH有关:常用pH8~9,蛋白质带负电 2.与溶液离子强度有关:愈高,泳动慢,一般0.02~0.2M 3.与电场强度有关:愈高,愈快,一般4~6v/cm(琼脂长),约40v左右 4.电渗作用的影响 电渗作用:电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象。电渗方向与电泳方向相反。 (一)对流免疫电泳 (counter-immunoelectrophoresis) 原理:定向加速的免疫双扩 (双扩+电场,使抗原、抗体相对泳动) 方法: 抗原、抗体分别在琼脂板上不同孔内,抗原在负极端,抗体在正极端,电泳。 电压:4~6v/cm(琼脂长度) 电泳时间:45分钟~1小时 - 抗原 抗体 对 流 免 疫 电 泳 PH:8.6 Ag:-,借助电泳由负向正极运动; Ab:-少,分子又大,重,电泳慢, 因电渗反而由正向负极运动。 优点、用途: 耗时短,反应敏感性强。 用于HBsAg、AFP等检测 * * 沉 淀 反 应 (precipitation reaction) 概念: 可溶性抗原与相应抗体结合,在电解质存在,两者比例恰当时,可出现肉眼可见的沉淀现象. Ag 沉淀原 Ab 沉淀素(precipitin) 实验中为使抗原抗体比例(数量)恰当,应稀释Ag 颗粒性抗原: 光镜下可见,肉眼观呈浑浊悬液,如细菌、RBC等。 可溶性抗原: 光镜无形态,肉眼观呈澄清透明,如血清蛋白溶液、多糖抗原等。 凝集反应 沉淀反应 分类: 液相沉淀:絮状沉淀试验、环状沉淀试验 免疫比浊测定法 凝胶扩散:双向琼脂扩散试验、单向琼脂扩散 试验等 凝胶免疫电泳:免疫电泳、对流免疫电泳、火箭 免疫电泳等 一.液相沉淀反应 (一)絮状沉淀试验 (flocculation) 抗原抗体结合,在电解质存在的情况下出现絮状/块状沉淀 既可在试管内进行,也可在玻片上进行。 用于:玻片法常用于定性测定 试管法在沉淀试验前,应测试抗原、抗体最佳稀释度,一般用方阵滴定方法。 半定量检测。 方阵最适比测定 抗体 抗 原 稀 释 度 稀释度 ——————————————————— 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12 对照 1/5 + ++ +++ +++ ++ + ± - - 1/10 + ++ ++ ++ +++ ++ + - - 1/20 + + ++ ++ +++ ++ + - - 1/40 - ± + + ++ +++ ++ + - 1/80 - - - - + + + + - (二)环状沉淀反应 方法:在环沉管(0.2×3cm)中进行。 先加抗体,后加抗原。静置 30分钟后观察在Ag、Ab交界处是否有白色沉淀环,若有,为阳性)。 用途:多用于测抗原(法医学上血迹鉴定等) 环状沉淀试验 1.毛细玻管,内径1.5~2mm 2.下层置血清(Ab),上层置Ag(不能颠倒) 抗原、抗
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