细胞凋亡小体与梯状DNA的观察_百替生物.pdf

实验六 细胞凋亡小体和梯状 DNA 的观察 一、实验目的 1 掌握诱导细胞凋亡和观察细胞凋亡小体的方法 2 掌握 DNA 电泳检测方法，证明凋亡细胞DNA Ladder 的存在。 细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可分为两种类型：细胞坏死（necrosis） 和细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。后者也称细胞凋亡（apoptosis）。 细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡，以细胞质膜的破裂为特征，造成内含 物的炎性泄露，是一种非正常死亡。细胞凋亡是细胞的一种 “主动性”死亡行为，由基因 控制，表现为细胞染色质凝集并边缘化、细胞浓缩、凋亡小体产生及 DNA 片段化等。由于 片段化而形成的 DNA Ladder 被认为是细胞凋亡的典型特征。 细胞程序性死亡被分为两类：受体介导的细胞程序性死亡和线粒体介导的细胞程序性 死亡。本实验主要涉及到线粒体介导的凋亡途径。线粒体可以进行氧化磷酸化并产生 ATP， 同时它还可以诱导产生PCD 发生的物质-细胞色素 C （cyt C）的泄漏。线粒体膜上存在 Bax 组成的孔道。Bcl-2 等抑制它的开放，从而抑制 PCD 因子的释放和阻止PCD 的发生。而Bad 等促进 Bax 开放，从而导致 Apaf: apoptosis protease activating factor 活化，使 cyt C 的释放，促进Cyt C,Apaf-1, caspase-9 复合物的形成，使得细胞处于细胞凋亡的执行 阶段（见图 10-7）。凋亡的标准特征之一，是基因组 DNA 断裂为 180-200bp 的多条寡核 小体片段。此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。DNA 梯状序列最后可在 紫外灯下显示，人们可以照像记录它的电泳行为。根据 DNA 的电泳行为，人们就可以判断 出细胞死亡的类型。凋亡细胞形成明显的梯状 DNA，坏死细胞为不清晰弥散状 DNA，而活 细胞 DNA 在琼脂糖凝胶的顶部，是一个没有受到切割的高分子量条带。 二、实验原理 Cyt c 是电子传递链的重要组成部分，定位于线粒体内，是真核细胞内不可缺少的重 要因子。但当他溢出线粒体后就会诱导细胞凋亡。在本实验中，对洋葱内表皮、烟草悬浮 细胞或人口腔内皮细胞等加入 Cyt c 或其他诱导物，观察诱发产生的凋亡细胞。用改良苯 酚品红染色观察凋亡细胞核发生染色质凝集（condensation）、趋边化(margination)、 DNA 裂解（fragmentation） 产生凋亡小体等形态学上的变化，用琼脂糖凝胶 DNA 电泳检 测细胞凋亡后形成的 DNA Ladder。 service@100 三 、材料、试剂和仪器 1． 材料 采用的烟草悬浮细胞株系、洋葱内表皮和人口腔内皮细胞。 2． 试剂的配制： service@100 1）烟草悬浮细胞的基本培养基 2）100 μmol/l Cyt c 的水溶液 3) 170 nmol/L 或 230 nmol/L 的CaCl2 4）改良苯酚品红染色 先配母液 A 和 B。 母液 A 称取 3g 碱性品红，溶于 100mL 的 70%酒精中（此液可长期保存）。 母液 B:取母液 A 10mL，加入 90mL 的 5%石碳酸水溶液（2 周内使用）。 苯酚品红染色液：取母液 B 45mL，加入 6mL 冰乙酸和 6mL 37%的甲醛。 改良苯酚品红染色：苯酚品红染色液 2-10mL，加入 90-98mL 45%的醋 酸和 1.8g 山梨醇。 此染液初配好时，颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室 温下不产生沉淀而较稳定。 5） 1% 的琼脂糖凝胶 6） 2ⅹCTAB buffer：2％（w/v）CTAB、100mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、1％ PVP、 7) 氯仿:异戊醇 (24：1) 四、实验程序 1． 取样 1）直接撕取洋葱内表皮和刮取人口腔上皮细胞 2）烟草悬浮细胞的培养 烟草