Bac-to-Bac_表达系统精简.doc

Bac-to-Bac 表达系统I. pFastBac-X重组质粒的构建利用分子生物学技术构建所需的pFastBac重组质粒,以DH5α为宿主,进行扩增.(以下以pFastBac-X为例进行说明.II. pFastBac-x重组质粒的转座步骤：1.??制备LB琼脂平板。LB培养液（含Agar）：胰蛋白冻10g/l，Nacl 10g/l，酵母提取物 5g/l，Agar 15g/l高压灭菌后，培养基温度下降至60℃左右迅速加入下列成分：卡那霉素 50ug/ml庆大霉素 7ug/ml四环素 10ug/mlBluo-gal 100ug/mlIPTG 40ug/ml各成分混匀后，乘热在每块平板中加入约20ml培养基，待凝固后放置37℃烘箱干燥产生的水汽。2.??取出DH10BacTM感受态细胞冰上融解。3.??用移液枪吸取100ulDH10BacTM感受态细胞于1.5ml EP管。4.??轻轻加入1ng（约5ul）重组质粒X于感受态细胞中，轻轻敲打管壁使之混匀。5.??冰上放置30min。6.??42℃循环水浴静止45秒。7.??快速放置冰上2min。8.??在上述管中加入900ul S.O.C.培养基。9.??将EP管置于37℃摇床（225rpm）4h。10.??用S.O.C.稀释上述细胞至10－1、10－2、10－311.??在每块LB培养基中加入上述稀释液100ul，涂布均匀。12.??37℃培养24－48h。（单克隆很小，24h前很难分辨是否为蓝色克隆）注：1）1、3、4、8、10、11在超净台内进行。2）用X－gal代替Bluo-gal会降低颜色浓度。真正的白色克隆在菌落长得较大时还是呈白色，建议在黑色背景下进行挑选。III. 重组Bacmid DNA的分离提取（在提取前，可以在含Bluo-gal的LB琼脂平板上划板进一步确认）溶液配置：溶液Ⅰ：Tris-Hcl(15Mm) 0.119gEDTA (10Mm) 0.187gRnase (100ug/ml) 0.5ml(贮备液10mg/ml)用纯水溶解并定容至50ml（调pH8.0）溶液Ⅱ：NaOH 0.2NSDS 1%溶液Ⅲ：醋酸钾（3M） 14.7g溶解定容至50ml，pH5.5TE溶液：1.??挑取白色克隆于2mlLB培养基（含50ug/ml卡那霉素、7ug/ml庆大霉素、10ug/ml四环素），37℃摇床250－300rpm培养24h以上。2.??取1.5ml培养物于1.5mlEP管中，14000×g离心1min3.??倒去上清夜，倒立于吸水纸上。然后加入0.3ml的溶液Ⅰ用枪头轻轻吹打重悬细胞。4. 加入0.3ml溶液Ⅱ，轻轻混匀，室温放置5min（溶液变清）缓缓加入0.3ml溶液Ⅲ，轻轻混匀，形成蛋白及DNA沉淀，冰上放置5－10min。5. 14000g室温离心10min，期间另取一2ml离心管，加入800ul异丙醇。6. 轻轻把上清液转入含异丙醇的离心管，避免把白色沉淀带入。轻轻倒转离心管数次。冰上放置5min（该过程可放在－20℃过夜）。7. 室温离心15min8. 去上清，倒置离心管于吸水纸上，然后加入70％乙醇洗涤沉淀数次，14000g室温离心5min9. 尽可能弃去上清，小心操作，勿使沉淀弃去。10. 使沉淀在空气中自然挥干，5－10min。加40ulTE溶液，轻敲管底，使溶液位于管底部。只要沉淀没有过分挥干，DNA在10min内就可以用了。注：1）重组Bacmid－X大于100kb，故在操作过程中应避免机械力剪切，破坏重组粘粒的完整性。2）将提取的Bacmid－X溶液分装，避免冻融次数过多而降低转染效率。IV. 重组Bacmid－X转染sf9细胞的操作步骤1.??在六孔板中接种9×105个细胞/2ml/孔。其中培养基Grace’s medium中含有青霉素50U/ml，链霉素50ug/ml，10％FBS。2.??27℃培养1h，使细胞贴壁。3.??在这期间制备Bacmid－X与Cellfectin Reagent复合物a.??用100ul不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）稀释1ug Bacmid－X（约5ul）b.??在使用前将Cellfectin Reagent倒置5－10次，使其充分混匀，取6ul Cellfectin Reagent用100ul不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）稀释。c.??将上述两种稀释液合并（总体积约210ul），轻轻混匀，室温孵育15－45min。4.??在制备Bacmid－X与Cellfectin Reagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Gr