DNA酶切及凝胶电泳.pptx

;DNA限制性内切酶的酶切分析;1. 寄主控制的限制与修饰现象;2.核酸限制性内切酶的类型及基本特性;Ⅱ型：限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。 这类限制酶识别的专一核苷酸顺序常见的是4至6个核苷酸，其识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴。;Ⅱ型酶的切割有两种方式，分别生成平头末端、粘性末端。;Ⅲ型：限制性内切酶有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。 结论：Ⅱ型限制性内切酶的特性使它在分子克隆中得到了广泛应用，是重组DNA的基础。;3.同裂酶和同尾酶 同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。这些有相同切点的酶称为同裂酶。 同尾酶：有时两种酶切割顺序不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。 ;4.影响核酸限制性内切酶活性的因素;用途 用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基序列分析；比较相关的DNA分子和遗传工程。;电泳概述;分类：按照分离原理的不同，可分为：区带电泳、移界电泳、等速电泳、等电聚焦电泳 应用：生物学上的可移动大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等，具有可以电离的基团，在具有一定pH值的溶液中，能够形成带电荷的阳离子和阴离子，通过电泳方法可以将处于同一体系的不同组分分开。;凝胶电泳技术;凝胶电泳优点 (1) 样品不易扩散 (2) 制备简单，时间短； (3) 将分子筛效应和电荷效应结合在同一方法中，提高分辨能力； (4) 需要合成用的原料纯净，制成的多聚物的再现性高，因此样品分离的重复性也比较高； (5) 可以随意控制凝胶浓度，按需要可制作不同孔径的凝胶； (6) 一定浓度范围内透明性好，机械轻度好，有弹性； (7) 链上具有不活泼的酰胺基，没有带电的其他离子基，所以电泳时不会产生电渗； (8) 用途广泛，可以对核酸、蛋白质等生物高分子进行分离、定量、定性、分子量的测定； (9) 需要样品量少，1-100μg 已经足够。;琼脂糖凝胶电泳 ; 以琼脂糖凝胶电泳实验为例，待测 DNA 片段与已知浓度的DNA片段同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，分析其含量： ;2.仪器 紫外投射反射分析仪，电泳槽，电泳仪。;图1 电泳槽;图2 电泳仪电源;3.试剂 (1) 6*上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液； (2) 50*TAE电泳缓冲液：Trish 碱 242g，冰乙酸 57.1ml，0.5mol/L EDTA100ml，加水溶解后定量 1000ml； (3) 5mg/ml EB（溴化乙锭）：0.5g EB，100ml 双蒸水。;4.操作步骤 (1) 称取 1g 琼脂糖凝胶干粉，加 100ml 1*TAE 电泳缓冲液，加热使琼脂糖熔化均匀，取出后室温冷却至 50~60℃；（制作凝胶液） (2) 将胶倒入制胶槽中，并插入样品梳，待充分凝固后拔出样品梳；（插梳子） (3) 将凝胶板放入电泳槽中，加入 1*TAE 电泳缓冲液，使液面略高于凝胶 1*TAE电泳缓冲液；（加电泳缓冲液） (4) 5μl DNA 样品加 1μl 6*凝胶加样缓冲液，搅拌均匀后全部加入凝胶板的样品孔中；在另一加样孔中加 5μl 已知片段大小的 DNA 标准溶液；（上样） (5) 打开电源开关，电压 100V，电泳约 30~40 分钟； （通电，跑电泳） (6) 取出泳动后的凝胶板，EB 染色 20 分钟后才在紫外分析仪中观察 DNA 区带。（取出凝胶，分析电泳结果） ; 一般情况下，实验后分析结果一般用肉眼观察，通过比较待测 DNA 的条带与已知 DNA 的各条带的荧光密度，估计待测 DNA 在凝胶中的含量和浓度。;谢谢聆听!