DNA芯片技术的原理与应用.pptx

DNA芯片技术的原理与应用;;1 DNA芯片技术的一些概况; DNA芯片技术，实际上就是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成( situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过计算机对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。由于常计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。 ; 基因芯片制备及检测流程是利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸以预先设定的排列方式固定在固相支持介质表面,形成高密度的寡核苷酸的阵列,样品与探针杂交后,由特殊的装置检出信号,并由计算机进行分析得到结果。 ;原理如下图：;基因芯片;基因芯片发展历史;近7(2011.9前)年来公开发表的与基因芯片相关的学术论文;1.2 DNA芯片分类;1.3 DNA芯片的优点 作为新一代基因诊断技术，DNA芯片的突出特点在于快速、高效、敏感、经济，平行化、自动化等，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片技术具有明显的优势： （1）快速准确 （2） 检测效率高 （3）基因诊断的成本降低。 （4）自动化程度高 （5） 避免了交叉感染 （6）多功能 （7）高度的平行性;DNA芯片技术的步骤;1.4.1 DNA芯片的制备; 原位合成(In Situ Synthesis); 压电印刷法的基本原理类似于目前采用的喷墨打印机:打印头在方阵上移动,在方阵每点上电流使喷头放大,并将装有机某种碱基的试剂滴在晶片表面,然后固定,在洗脱和去保护后另一轮寡核苷酸的延伸就可以继续进行。压片印刷法由于不需要与载体表面直接接触,故有很高的效率,但制造工艺还不太成熟。 ;喷墨打印技术;离片合成法(off-chip synthesis)　首先利用各种方法制备出寡核苷酸探针，再由具有多个微细加样孔的阵列复制器(arraying and replicating device,ARD)及由电脑控制的机器将探针按一定的顺序固定在固相载体表面，再由紫外交线交联固定后得到DNA方阵。 该方法优点是芯片制造速度快,成本低,而且芯片之间制造误差小。其缺点是与原位合成法相比,构成方阵的DNA片段需要先合成、纯化，以及在制造DNA芯片前必须将如此大量具有微小差别的片段分别保存,并且需要特制的自动点样装置。; 点样法? 即预先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分离得到cDNA，再通过点样机直接将其点到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通过多孔玻璃合成法。肽核苷酸虽然在制备上比较复杂，但是它与DNA探针相比，由于PNA（肽核酸）与DNA结合的复合物更加稳定和特异，因而更加有利于单碱基错配基因的检测。 来自某一细胞的cDNA必须进行预处理，纯化，扩增以及分类，然后再利用机械手把它们准确地固定在基板的相应位置上，为了保证cDNA芯片检测的准确性，在制备cDNA芯片以前必须提高低表达基因cDNA的丰度，降低高表达基因cDNA的丰度。;1.4.2 样品的制备 样品的制备包括：样品的分离纯化，扩增，标记 分离纯化：样品来源于活的细胞，使用一定方法分离并纯化DNA或RNA（特别是mRNA）。只有达到一定纯度的样品，才能保证后续操作的正确。 ;样品的扩增：扩增的目的在于获得足够的样品量。现已发展出固相PCR系统。 样品的标记：主要采用荧光标记法，也可用生物素，或放射性核标记。标记的方式采用PCR或RT-PCR。常用的荧光色素为Cy3、Cy5。用Cy3、Cy5标记dNTP，经PCR后，产物即可被标记。??测样品和对照可采用双色荧光标记。 ;1.4.3 分子杂交 芯片的杂交：将已知序列的DNA探针显微固化于支持物表面，将已标记好的样品与之进行杂交，杂交过程一般在30分钟完成。 电子基因芯片：杂交速度更快。 采用肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探针可消除DNA二级结构的影响。;1.4.4 遗传信息检测 原理：待测样品与支持物上探针列阵杂交后，荧光标记的样品结合在芯片的特定位置，未结合的探针被除去；样品与探针严格配对的杂交分子，热力学稳定性高，产生的荧光信号强，不完全配对的，荧光信号弱；不能杂交不产生荧光信号。 分析：采用激光扫描或激光共聚焦显微镜采集杂交信号（位置、强度、颜色），并与对照比较，经相关软件进行图像和数据处理。即可得也待测样品的信息。 经以上获得的数据十分庞大，还需进行分析，比较，归纳，才能得出明晰的结论。; ;DNA芯片的应用