Thermo-Scientific-RevertAid-First-Strand-cDNA-Synthesis-Kit-K1621说明书(第一链cDNA合成试剂盒).docx

RevertAid?第一链cDNASynthesis试剂盒#K1621,#K1622分析证明书#K1621Lot质量控制采用100fg对照GAPDHRNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496bp的产物质量认证人：JurgitaZilinskiene目录页码试剂盒组成…………………………………………………………….2存储条件……………………………………………………………….2产品说明……………………………………………………………….2注意事项…………………………………………………………….....3操作步骤…………………………………………………………….....6RT-PCR…………………………………………………………….6合成cDNA用于克隆………..………………………………………7实验对照……………………………………………………………….8问题分析与解决……………………………………………………...10试剂盒成分RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒20次#K1621100次#K1622RevertAid?M-MuLV反转录酶（200u*/μl）25μl120μlRiboLock?RNA酶抑制剂(20u**/μl)25μl120μl5×反应缓冲液（250mMTris-HCl(pH8.3),250mMKCl,20mMMgCl2,50mMDTT）150μl500μl10mMdNTP混合物50μl250μlOligo(dT)18引物100μM,0.5μg/μl(15A260u/ml)25μl120μl随机六聚体引物100μM,0.2μg/μl(6A260u/ml)25μl120μlGAPDH正向引物,10μM5’–CAAGGTCATCCATGACAACTTTG–3’20μl20μlGAPDH反向引物,10μM5’–GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’20μl20μl对照GAPDHRNA1.3kb3’-poly(A)tailedRNAtranscript,0.05μg/μl20μl20μl无核酸酶高纯度水2x1.25ml2x1.25ml*一个单位的RevertAid?M-MLV逆转录酶在37℃10分钟将1nmol的dTMP转化为多核苷酸组分（吸附在DE81上）。**一个单位的RiboLock?RNase酶抑制剂抑制5ngRNA酶A50%的活性。存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。产品说明RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试剂盒使用RevertAid?M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。试剂盒中含有RiboLock?重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18选择性和RNA3’poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。注意事项避免核酸酶污染RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。RNA很容易被RNA酶A降解，而RNA酶A广泛稳定地存在于实验室中。试剂盒中的所有成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。为防止污染，实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。避免RNA酶污染的常规建议：●用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具。●整个实验过程戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。并经常更换手套。●使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶（比如#R0581，无RNA酶的高纯度水）●使用RNA酶抑制剂，比如试剂盒中提供的FermentasRiboLock?RNA酶抑制剂来保护RNA。●试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子要确保扣严。模板RNA通过标准方法得到的细胞总RNA可用本试剂盒获得第一链cDNA。纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物（然后再用75%冷乙醇冲洗沉淀两次）。如果要进行