分离工程第六章.pptVIP

第六章 色 谱 又称层析或色层分离。属高度纯化技术。 初步纯化技术：超滤，离心，沉淀，溶剂萃取，膜分离，吸附等。 高度纯化技术：选择性沉淀或结晶，电泳，络合，层析等。 对药品，特别是注射用药品和基因工程菌生成的产品，都需要高度纯化。 气相色谱 液相色谱 特点 分离精度高、设备简单、操作方便。 应用 物质成分的定量分析与检测； 生物物质的制备、分离和纯化。 第一节 色谱原理与分类 一、原理 根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。 互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。 生物分离主要用柱层析，柱层析处理量大。 固定相分配系数大的后被洗脱。 二、分类 流动相与固定相 压力 以固体为固定相的液相柱层析中，根据操作压力的不同分为： 分离操作方式 根据分离操作方式不同分为: 洗脱展开（洗脱层析） 料液中的溶质根据其在固定相和流动相间分配行为的不同，在层析柱出口处被展开形成相互分离的层析峰。 顶替展开 利用一种吸附力比各被吸附组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中次序顶替出来。 可以选用不同的洗脱方案 最简单的是无梯度洗脱：即在整个色层分离中，使用一种恒定组分的洗脱液（恒定的洗脱能力）。如果溶质的特性非常相似或非常不同这种形式的洗脱很少用，这种情况，有一些组分会快速洗脱而另一些会强烈地阻滞。 采用梯度洗脱（阶梯式洗脱）：洗脱剂的洗脱能力可以连续或分段的提高。 三种操作方法中，洗脱展开最常用。 分配机理 根据溶质与固定相之间的相同作用机理，液相层析法可分为： 第二节 凝胶过滤层析 一、原理与操作 原理 利用凝胶粒子（凝胶过滤介质）为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。 操作 一般采用恒定洗脱法，即采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开。 分子筛凝胶色谱原理 二、凝胶过滤介质 对凝胶过滤介质的要求 亲水性高，表面惰性，即与溶质不发生任何化学或物理相互作用； 稳定性高，对pH、离子强度及化学试剂稳定，使用寿命长； 具有一定的孔径分布范围； 机械强度高，允许较高的操作压力。 常用商品化凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 Sephadex G，传统的软凝胶过滤介质，目前仍广泛使用，但机械强度低。 琼脂糖凝胶 Sepharose，常用，但机械强度较低； Sepharose CL，用环氧氯丙烷交联制备，机械强度较高； 此类凝胶经化学修饰后用于IEC、HIC和AC。 其他 TSK凝胶，利用亲水性高分子合成制备，机械强度较高，经化学修饰后也常用于IEC和AC； Superdex凝胶，将葡聚糖共价交联到高度交联的琼脂糖珠体上制备的刚性凝胶，分离精度高，用于高效液相层析； Superose凝胶，琼脂糖经二次交联制备的刚性凝胶，常用于高效IEC和AC。 凝胶特性参数 排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。 分级范围：可分离的溶质的相对分子量范围。 溶胀率：溶胀后每克干凝胶吸收水分的百分数。 凝胶粒径：多用筛目或微米表示。粒径越小，分离效率越高。软凝胶粒径较大，硬凝胶粒径较小。 床体积：1g干凝胶溶胀后所占有的体积。 空隙体积：层析柱中凝胶之间空隙的体积。一般用水溶性蓝色葡聚糖（2000KD）测定。 三、应用及特点 应用 分离纯化 用于分离的相对分子质量范围：几百到106。 用于蛋白质、多肽、脂质、抗生素、糖类、核酸及病毒等生物物质的分离纯化。 还可用于医药产业中无热原水的制备及低分子生物制剂中抗原性杂质的除去。 脱盐 生物分离中主要用于生物大分子溶液的脱盐及除去小分子物质。 还用于溶解目标产物的缓冲液的交换。 凝胶主体还可以加入其它交换基团，如磺酸基，羧甲基，二乙基氨基乙基等，这些物质既有分子筛效应又具有一定的交换性能 相对分子质量的测定 在分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成正比. m(v)=a-blgMr. 故GFC可用于未知蛋白质相对分子质量的测定。 特点 优点 采用恒定洗脱法，操作条件温和，收率接近100％； 介质不需清洗或再生，易实施循环操作，提高产品纯度； 脱盐比透析速度快，精度高；比超滤剪应力小，活性收率高； 分离机理简单，操作参数少，规模放大容易。 缺点 选择性低，处理量小； 洗脱展开后产品被稀释。 第三节 吸附与离子交换 1、吸附 吸附：溶质从液相或气相转移到固相的现象。 活性炭：脱色，除臭等。 活性炭称吸附剂。 吸附剂：多孔微粒。 活 性 炭（Active carbon） 大孔网状吸附剂 特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳定；机械强度好