全内反射荧光成像基本原理.pptx

全内反射荧光成像基本原理 Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF);全内反射荧光显微镜(TIRFM); 目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描探针显微技术（SPM）和光学技术。其中： ; 上世纪80 年代，Axelrod 等生物物理学家对 TIRFM 技术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。;光反射和折射示意图;全内反射示意图;; 当入射角不断增大，透射角为增大 90°时，入射角达到临界角 θc。依据 Snell 定律得出：; 实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一部分透过的能量场则称之为“隐失波” 或“隐失场”。; 隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减：; 由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了显微成像的对比度和信噪比。; 隐失波的渗透深度d12是入射角及相对折射率的函数。 d12是渗透深度,它等于从分界面处到光强衰减到分界面处数值l/ e的处的距离。对于可见光波长而言，浸透深度约为100 nm。; 隐失波存在的实验证明;光学隧道效应; 全内反射荧光显微技术，是利用光发生全内反射时产生的隐失波照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。;全内反射荧光显微成像系统;分子荧光的产生;激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s;电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）; 当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子成对。这些能态都被称为单线态或单重态(singlet state)。 但如果处于第一电子激发态最低振动能级的电子通过无辐射跃迁（系间跨越，intersystem crossing)改变自旋方向，则因消耗部分能量而降至另一种激发态：S＝1/2＋1/2＝1，多重度 M＝2S＋1＝2?1＋1＝3，这种电子激发态称为三重态(triplet state)。 ;Π;分子荧光的产生 （雅布隆斯基分子能级图）; 荧光发射：电子由第一激单重态的最低振动能级到基态，多为S1-S0。由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，荧光的特征波长比入射波长要长。 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：10-9—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射，荧光马上会消失。 磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（10-4—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。; 目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。;全内反射荧光显微镜结构; 该系统的关键是高数值孔径物镜的使用。由于细胞的典型折射率为1．33～1．38，因此要实现全内反射，物镜的NA必须大于1．38，表达式为：;物镜型全内反射荧光显微镜示意图