分子生物学第一次讨论人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用.ppt

第一次讨论课 （2） 第3组 口腔1401班 原理 方法 注意事项 结果鉴定 人类细胞质RNA提取 原理 方法 RT-PCR的原理、方法 原理 结果分析 应用 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 人类细胞质RNA提取 真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。 RNA提取实质就是将细胞裂 解，释放RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质最终获得高纯度RNA产物的过程。 AAAAAA AAAAAA tRNA mRNA rRNA 人类细胞质RNA提取 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。在分离RNA的过程中，用抑制剂以抑制RNA酶的活性。 RNA提取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品，取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。 建立一个无RNA酶的环境 Trizol法 * DEPC,焦碳酸二乙酯 RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的活性基团组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。 有效浓度：0.05%---0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 ?C 1 h。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 ?C ，或液氮中。 人类细胞质RNA提取 Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物。 异硫氰酸胍可裂解细胞，并使RNA与蛋白质分离。酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。 人类细胞质RNA提取 破碎组织 分离RNA 沉淀RNA 融解RNA 保存RNA 洗涤RNA 可以用盐酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎组织 加入β-ME可抑制RNA酶的活性 一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，离心。RNA分层于上部。 一般用乙醇、3M NaAc 或异丙醇 使用70%乙醇洗涤，洗涤后可以晒干或烤干乙醇（但是不能过于干燥，否则不易溶解） 人类细胞质RNA提取 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活 人类细胞质RNA提取 全程佩戴一次性手套。皮肤带有细菌和外源性核糖核酸酶，可能污染RNA。 * 内因：核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解 外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活 人类细胞质RNA提取 完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。 若两条带不明显, 则说明RNA部分降解。 人类细胞质RNA提取 RT-PCR 原理及方法 逆转录PCR原理及方法 知识背景 基因表达 RT-PCR原理简介 RNA cDNA 目的 片段 PCR RT 实质——聚合酶链式反应（PCR）广泛应用的变形. 知识背景 RT (reverse transcription ） 即逆转录，指以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。逆转录过程是RNA病毒的复制形式之一，需逆转录酶的催化。 RNA cDNA 逆转录 RT 逆转录酶的选择 RNA cDNA 逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1.依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2.Rnase水解活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子； 3.依赖DNA的DNA聚合酶活性:以反转录合