各种特殊生物显微镜的原理和使用.ppt

* Leica K镜扫描，速度慢，不灵活 激光 物镜 标本 共聚焦针孔 (Pinhole) 光电倍增管 (PMT) 荧光滤光片 (发射光滤色片) 共聚焦原理 扫描？ X线上的荧光强度变化 多条线构成2维图像 * X Y 扫描显微镜 Z 显示器 标本 标本 PMT PC 为什么用PMT（光电倍增管）？ 相比CCD，PMT拥有更高的感光效率 更快的读出速度（微秒级） PMT采集时间信息——电脑还原为位置信息 共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片 3. 增加侧向分辨率 4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响 宽场照明显微镜和共聚焦图像比较 激光扫描共焦显微镜的设计特点: 1.点照明，激光光源 2.具有照明小孔和探测小孔 3.照明小孔和探测小孔共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4.具有扫描系统——逐点扫描成像 5.无损伤、连续光学切片，显微“CT” 6.真正的三维重组 7.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 激光共聚焦显微镜的组成 激光共聚焦显微镜一般由 激光光源，显微镜和成像系统三部分组成 激光光源 Laser lines （Cofocal) 405, 442, 457, 477, 488, 514, 543, 568, 637 nm 例如：蓝光激光二极管 405nm excitation. HQ442/45 emission filter (DAPI) Applications e.g. DAPI, Hoechst CFP Pacific Blue others….. 氦-氖激光( HeNe laser )543 nm ,633 nm 氩激光( Ar laser) 458, 477, 488, 514 ,568nm, 显微镜 Upright Microscopes Nikon E600 Nikon E800 Nikon E1000 Nikon Optiphot 2 Zeiss Axioplan 2 Zeiss Axioskop Olympus BX50/51 Olympus BX50WI Olympus BX60 Olympus BH2 Inverted Microscopes Nikon TE2000 , TE300 Nikon Diaphot 300 Zeiss Axiovert 200 and TV Zeiss Axiotech Olympus IX70 and TVR 激光共聚焦显微镜在生物学中的应用 。 组织光学切片 三维图像重建 Cy2-anti- basement membrane protein Cy3 anti- neuronal processes Cy5 anti-blood vessel protein. 多荧光标记分析 动物细胞间的胞间通讯研究 植物细胞间的胞间通讯研究 植物细胞中胞间连丝相关蛋白Rab11的定位 A confocal image of a 6-day-old zebra fish (dorsal view) embryo that has been double-labeled with antibodies against cell adhesion molecules shows staining of different subpopulations of axons in the nervous system.. Photonic Solutions for Biotechnology and Medicine November 2002 活体状态下细胞的动态变化 拟南芥侧根顶端分生细胞的分裂 活细胞延时实验： 根据激光发生器的不同，目前可分为单光子激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning Microscopy ）、双光子激光扫描显微镜( two-photon excitation Microscopy)和多光子激光共聚焦显微镜（ Multi-photon Microscopy）。 two-photon excitation (TPE) Microscopy 双光子激光扫描显微镜 双光子激光扫描显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的激发态寿命后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个 1／2波长的光子的单光子激发相同。 Multi-photon uses long waveleng