吴乃虎《基因工程原理》4-6知识点总结.doc

基因操作的主要技术原理 基因操作的方法包括:大分子DNA的提取、DNA分子的切割和连接、 核酸分子杂交、 凝胶电泳、细胞转化、DNA序列分析、基因的人工合成、基因定点突变、PCR扩增等。DNA分子的切割和连接是基因操作的核心技术。 一、核酸的分离和纯化技术 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。 DNA：真核生物染色体DNA——双链线性； 真核生物的细胞器DNA——双链环状； 原核生物的核区DNA、质粒——双链环状。 RNA：RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子。 一般生物体基因组DNA大小为107-8bp。 DNA提取的目的 （1）可用PCR从基因组中扩增基因； （2）作RAPD分析，区别两种物种之间的亲缘关系； （3）作Southern分析，检测是否转入基因；探测同源的基因； （4）作酶切图谱，用于DNA测序。 （一）总DNA的提取 DNA在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0。14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 总DNA：一般来说是指基因组DNA ，即细胞核内的染色体DNA分子。 核DNA分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个DNA分子。其长度与直径的比例极不对称性，使其对极械力十分敏感。分离纯化中DNA分子的断裂是很难避免的。尽可能保持DNA分子的完整性是DNA分离技术的关键。 （1）有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则： ①防止和抑制内源DNase对DNA的降解； DNase 以Mg2+ 、Mn2+为辅助因子，只要加入一定 的螯合剂， 如EDTA（乙二胺四乙酸钠）、柠檬酸便可。 ②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。 动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。 （2）DNA提取的主要操作过程 （3）DNA提取的主要问题及解决方法： ①DNA沉淀呈棕色，很难酶切或扩增； 多酚、单宁、色素等氧化所致。提取液中加入抗氧化剂可使问题得到解决。 ②DNA沉淀中混有大量多糖或RNA杂物； 电泳回收、梯度离心 ③DNA降解，琼脂糖凝胶电泳上呈弥散状。 材料是否新鲜，试剂、器具是否灭菌 （二）质粒DNA的提取 1、质粒提取分三步进行 1、 碱抽提法提取质粒DNA 原理： 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 在碱变性条件下（pH=12。6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4。8的醋酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 步骤： 质粒DNA粗制品— 影响质粒DNA产量的因素 （1）受体菌株 一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株如DH5α。 endA基因表达非特异性核酸内切酶Ⅰ，它能使所有DNA双链解开。所以不要endA基因。 （2）质粒拷贝数 直接决定DNA产量的重要因素之一，质粒本身的性质所决定。 （3）质粒大小 分子量大的质粒，拷贝数少。 （三）RNA的分离 从细胞中分离的RNA的纯度与完整性对分子生物学实验至关重要，如Northern杂交分析、选择分离 mRNA、cDNA合成、体外翻译及mRNA差别显示技术分离基因等实验，在很大程度上取决于RNA的质量。 RNA酶 RNase不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。 2、RNA分离的关键因素： （1）Rnase污染的主要来源； （2）实验室中防止污染的有效措施。 3、注意事项：控制潜在的RNA酶的活性 （1）实验用具的去RNA酶处理 ①玻璃器具：180℃ 烘烤8h，或更长。 ②塑料制品：0。1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡（37℃，2h）或室温过夜，120℃灭菌。 ③电泳槽：氯仿/NaOH冲洗或3%H2O2和0。1% DEPC处理的水浸泡。 （2） H2O：0。1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制 部分试剂不能用DEPC处理，如Tris ， （3） 其他 4、RNA酶抑制剂 （1）人胎盘RNase抑制剂； （2）氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）； （3）硅藻土（吸附 RNase ）。 5、RNA的抽提和纯化 （1）常用RN