基因工程基本原理及操作方法介绍 改.ppt

(2)PCR法 如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞可能含有目的基因。 (3)DNA限制性内切酶图谱分析 用重组时的限制性内切酶切割重组子DNA，凝胶电泳后获得与目的基因一致的片段，即证明重组子中有插入序列。 (4)免疫学法 利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合作用进行筛选。 (5)核苷酸序列测定 宿主细胞的分类： 大肠杆菌 酵母 上游常用载体、克隆菌及表达菌类型 大肠系统 常用载体：PET-3C、30a 克隆菌：Top10 表达菌： BL21（DE3） 、BL21（DE3）plysS 酵母系统 常用载体：pPICZaA、pPIC9K 克隆菌：Top10 表达菌：X-33、GS115 谢谢 * * 基因工程基本原理及操作方法 2016.7.30 在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接从生物体的哪些结构中提取？ 药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。 传统生产方法的缺点 由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。 可利用什么方法来解决上述问题？ 利用基因工程方法高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。 基因工程药物异军突起 基因工程药物优点 * 1. 什么是基因工程——基因工程的概念与流程。 2. 怎样进行基因工程构建——基因工程构建步骤 3. 为什么能进行基因工程——基因工程常用技术与原理 1、概念：基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是把A生物的特定基因提取或人工合成，加以修饰改造后转化到B生物的细胞里，通过B生物表达A生物的蛋白。 例如，将合成的人胰岛素基因转化到毕赤酵母中，通过毕赤酵母表达人胰岛素蛋白。经提纯后用于糖尿病患者。 2、步骤： (1)重组质粒构建； (2)重组质粒鉴定; (3)转化表达菌； (4)筛选高表达菌种； 上游操作的基本流程可简化为：切、接、转、增、检。 3、整体流程： 重组质粒构建（酶切与连接） 转化表达菌 分为大肠杆菌系统和酵母系统： (1)大肠杆菌： 我公司目前一般采用氯化钙导入法； (2)酵母系统： 我公司目前一般采用电击法。 4、高表达菌种的筛选 (1)常规表达筛选： 一般为摇床法，通过挑取不同单克隆培养后，取样电泳确定表达量，缺点是效率低，优点是比较可靠； (2)高通量筛选法： 采用Elisa法，基于免疫反应。优点是效率高，可迅速筛选到高表达菌株，缺点是与实际表达量可能有一点偏差，需将筛选到的高表达菌种进一步进行摇床验证。 1.基因的“剪刀”──限制性核酸内切酶（限制酶） 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。 2.基因的针线──DNA连接酶 连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来（磷酸二脂键），使之成为一个完整的DNA分子。 基因的针线：DNA连接酶 G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用同种限制酶切割 3.基因的针线──基因的运输工具——运载体 4.基因的获取──全基因人工合成或PCR扩增 (1)全基因人工合成： 委托外公司进行全基因人工合成获得目的基因序列； (2)PCR扩增： PCR扩增3个基本条件包括模板基因序列、引物和原料（DNA聚合酶、4种碱基等原材料） a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 其中，退火温度比较关键，可能会影响特异性及效率 氢键 单链DNA 双链 DNA链 5.PCR技术扩增目的基因步骤; 6.将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌系统： 6.将目的基因导入微生物细胞 酵母系统： 7.目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是100%，构建载体、选择宿主细胞时都应考虑筛选问题。 常用筛选方法： (