微生物限度检查标准程序.doc

微生物限度检查标准程序 目的：建立个微生物限度检查标准程序。 范围：适用于各种原辅料、部分成品及验证的微生物限度检查的操作。 职责：检验人员对本规程的实施负责。 程序： 4．1 总则： 4．1．1 本法是指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。 4．1．2 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。 4．1．3检查全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。 4．1．4除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30~35℃，霉菌培养温度为25~28℃，控制菌培养温度为36±1℃。 4．1．5检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4．2供试品的检验量 每批供试品检验量一般为10g或10ml。供试品须取自2个以上的包装单位。 4．3供试液的制备 按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。 4．3．1 液体供试品 取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。 4．3．2 固体供试品 称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠100ml中，用匀浆仪或其它适宜办法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。 4．3．3 含抑菌成份供试品 供试品如干扰控制菌检验，可用下列方法处理后，依法检查。 4．3．3．1 稀释法 将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。 4．3．3．2 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心（每分钟3000转）30min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可将离心（每分钟500转）5min，取全部上层液，再行集菌处理。 4．3．3．3 薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm，孔径不大于0.45um±0.2um微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50~100ml，取出滤膜备检。 4．3．3．4 中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。 4．4 对照用菌液 控制菌检查均应做相应已知菌的对照试验。对照菌株为 大肠杆菌[CMCC（B）44 102]。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养 物1白金耳，接种置营养肉汤培养基内，培养18~20小时，稀释至1:106。对照菌的加入量为50~100个。 4．5 检查法 4．5．1 细菌、霉菌计数 4．5．1．1 平皿菌落计数法 4．5．1．1．1 取均匀供试液，进一步稀释成1:102、1:103等适宜的稀释级。 分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2~3个平皿。 营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点计霉菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。 4．5．1．1．2菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml置于4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。 细菌培养时间为48h，分别在24h及48h点计菌落数，一般以48h菌落数为准。霉菌培养时间为72h，分别在48h及72h点计菌落数，一般以72h菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。 点计后，计算各稀释级平均菌落数，按菌落报告规则报告菌数。 4．5．1．1．3 菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30~300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30~100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30~300（30~100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30~300（30~100）之间时，按下式计算两级比值： 高稀释级的平均菌落数×稀释倍数 比值= 低稀释级的平均菌落×稀释倍数 当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30~300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30~300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。如当1:10（或1:100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。 4．5．1．2 培养基稀释法 取供试液（原液或1:10、1:100供试液）3份，每份各1ml，分别注入