第11章免疫分析.ppt

5、微粒固相酶免疫测定仪 美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在微粒上。 第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体则通过膜滤出。 以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物为4-甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。 6、磁微粒固相酶免疫测定仪 瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和试剂组成： 试剂包括： 抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体 特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm） FITC结合的特异抗体或抗原 碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原 底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯 反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反应液呈粉红色。 什么样的反应 磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰酸荧光素(FITC)，另将一抗FITC抗体经化学反应与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂，生成夹心免疫复合物，洗涤，加酶底物显色。 三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养 （一）评价指标和方法 1．滤光片波长精度检查及其峰值测定 2．灵敏度和准确度 3．通道差与孔间差检测 4．零点飘移 5．精密度评价 6．线性测定 7．双波长评价 重点是光学部分 1．滤光片波长精度检查 2．通道差与孔间差检测 四、酶免疫分析仪的临床应用 １．病原体及其抗体的检测 2．各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3．肿瘤标志物 4．多种激素 5．药物和毒品 辣根过氧化物酶的色原底物 HRP最常用的色原底物有: 邻苯二胺(OPD)、2，2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸-6)[ABTS](杂环吖嗪) 四甲基联苯胺(TMB) 4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对 OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’-二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。 TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。 测定波长：450nm 氧化耦联色原底物对 HRP的氧化耦联色原底物对主要有4-氨基安替比林:苯酚耦联底物对(Trinder试剂)和2-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)；二甲基苯胺(DMA)耦联底物对(Ngo—Lenhoff试剂)等。 在H202存在下，4—氨基安替比林和苯酚经HRP作用缩合形成红色的醌亚胺，其在492 nm处有最大吸收 * * * * * * * 第十一章 免疫分析技术和相关仪器 第一节 酶免疫分析仪 一、酶免疫分析技术的分类： 酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA) 根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为: 酶扩大免疫测定 均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法 非均相酶免疫测定 固相酶免疫法 (酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 需要了解的基本概念 酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA) 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离才能测定. 分离的方法主要通过固相载体，故此法称为固相酶免疫测定ELISA 。 ELISA的测定模式 : 双抗体夹心法 间接法 竞争法 双抗体夹心法（三明治法）原理 固相支持物表面 包被抗体 标记抗体 待测物 夹心法的剂量--反应关系曲线 信号强度