第13章核酸扩增仪.ppt

PCR技术的发展简史 1953年，DNA双螺旋结构被发现 1963年，建立了核酸测序的方法 1971年Khorana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA的变性，与合适的引物杂交，在DNA聚合酶的作用下，引物延伸，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”（Khorana是一位出生于印度的美国分子生物学家。他在1968年，因为解出了遗传密码，而与罗伯特·威廉·霍利以及马歇尔·沃伦·尼伦伯格共同获得了诺贝尔生理学医学奖。） PCR技术的发展简史 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow（克列诺）片段，该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶的活性，其缺点是： ①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差。 PCR技术的发展简史 1988年，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 第二节 PCR扩增仪的分类与结构 四种PCR仪 实时荧光定量PCR核酸扩增仪 实时荧光定量PCR核酸扩增仪 PCR反应 实时荧光定量PCR核酸扩增仪 实时荧光定量PCR核酸扩增仪 Ct值得重复性误差 Ct值得含义： 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 要求Ct值的CV小于或等于2.5% 典型“S”型曲线 Ct值的意义：扩增达到阈值时的循环数 荧光检测 荧光检测范围 PCR是一个指数级扩增的过程，微量的起始拷贝数不同，经过几十个循环后，其荧光差别将十分巨大。 荧光检测要求范围：10-1010 检测的通道数量 复合PCR实验已成为一种流行趋势，要求仪器具有多通道检测能力。 目前的PCR仪4通道检测的居多，部分仪器具有6个检测通道。 简答题 1．什么是聚合酶链反应（PCR）技术？ 2．PCR核酸扩增仪的工作关键是什么？经历了怎样一个发展过程？ 3．PCR核酸扩增仪按照变温方式的不同可分哪几类？分别有什么特点。 4．什么是梯度PCR仪？它有什么优点？ 5．何谓荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术？ 简答题 6．实时荧光定量PCR仪有哪些种类，各有什么特点？ 7．PCR核酸扩增仪的温度控制包括哪些方面？ 8．为什么反应管温控比模块温控更准确？ 9．实时荧光定量PCR扩增仪的荧光检测系统主要由哪两部分组成？ 10．PCR扩增仪的热盖有什么作用？使用时应注意什么？ 简答题 11．简述PCR扩增仪的操作规程。 12．定量PCR扩增仪常见故障有哪些，如何解决？ 13．简述PCR核酸扩增仪的实际应用。 14. PCR核酸扩增仪可分哪几类？ 15. PCR扩增仪的性能指标有哪些? 其 他 常用样品管：0.2、0.5ml PCR管；8、12联排管；96孔微孔板等 其 他 新型的PCR仪都常规使用优质配套软件，此类软件易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序，及自动倒计时、自动断电保护等功能，很多仪器还可以免费升级。 PCR核酸扩增仪的操作规程 普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，按照程序设置温度或调出储存的程序运行即可。 定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。 PCR核酸扩增仪常见故障的排除 荧光染料污染样品孔：请工程师清洁样品孔； PCR管融化：可能是温度传感器出问题或是热盖出问题，需工程师检修； 个别孔扩增效率差异很大：可能的原因是半导体模块出现坏点，需工程师检修； PCR核酸扩增仪常见故障的排除 荧光强度减弱或不稳定：原因有滤光片发霉或有水汽等，需工程师检修；或光源损耗需更换光源；或需调节检测元件灵敏度，也需工程师调试； 仪器工作时出现噪声：可能的原因是PCR管没有放好；或风扇松动，需工程师检修； PCR核酸扩增仪常见故障的排除 仪器采集荧光时有不正常的噪声：某些光纤传导信号的定量PCR仪可能出现这一问题，需工程师检修或更换配件； 机器搬动后不能正常工作或不能正常采集荧光信号 对于某些光路系统复杂的仪器，应尽量避免自行搬动仪器。出现这种情况后需工程师重新调试; PCR反应假阴性 原因很多，其中PCR仪控温不准也是一个重要原因，可使用电子测温仪校准温度。 第四节 PCR核酸扩增仪的临床应用 感染性疾病的分子诊断和研究 遗传性疾病的分子诊断和研究 恶性肿瘤的分子诊断和研究 在移植配型中的应用 在法医学中的应用 在