第15章+核酸的研究方法.ppt

第15章 核酸的研究方法 3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 纯DNA 比值1.8，＜ 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染 扬州大学生物科学与技术学院 生物化学精品课程 扬州大学生物科学与技术学院 核酸的分离、提纯和定量测定 核酸的超速离心 核酸的凝胶电泳 核酸的核苷酸序列测定 DNA聚合酶链式反应（PCR） DNA的化学合成 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用 一、核酸的分离、提纯和定量测定 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，细胞破碎后采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。 DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇 （一）DNA分离纯化 也可用SDS破碎细胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚抽提，再用RNase分解除去RNA而获得纯化的DNA。 制备RNA时，最重要的是使RNase灭活： ①容器用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。然后经过高温处理。 DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性； ②加入强变性剂（如胍盐：可使所有蛋白质变性）使RNase失活； ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin) （二）RNA的分离 ① 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白 ②用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提：异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂。后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质 ③用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心，蛋白质在最上面，DNA在中间，RNA沉在底部 ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法 制备RNA的方法： （三）核酸含量的测定 2、定糖法 RNA：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm） 苔黑酚/地衣酚 浓HCl 浓硫酸 1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA 细胞或组织中核酸含量测定方法 生物组织 酸溶性物质 残留物 冷的稀酸抽提 脂类物质 残留物 热酸法 冷酸法 碱法 残留物 酸抽提液(RNA + DNA) 热酸提取 残留物 残留物 酸抽提液 (DNA) 热酸提取 酸抽提液 (RNA) 冷酸提取 酸抽提液 (RNA) 残留物(DNA) 有机溶剂抽提 碱降解再酸化 （四）、核酸纯度的测定 OD260／OD280 二、核酸的沉降特性与超速离心 利用超离心技术，可以测定核酸的沉降常数和相对分子质量。密度梯度沉降平衡超离心法在核酸分子构象的研究中应用颇广。DNA分析时，常用氯化铯密度梯度。主要应用于以下方面： 核酸密度的测定 测定DNA中的G-C含量 溶液中核酸构象的研究 用于核酸的制备 8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10 ρ ：未知DNA的密度 ρ0：为标准DNA的密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离 r0：已知DNA到转轴的距离 （一）核酸密度的测定 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系，因此可用能用该方法计算DNA碱基成分，计算公式为： ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（ρ-1.658）× 10 需注意的是： 含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值，不能用该公式计算。 （二）测定DNA的G-C含量 RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大 （三）研究核酸的构象 （四）用于核酸的制备 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来，利用EB（溴化乙锭）与核酸结合，能在紫外灯下发出荧光的特性，将目的区带收集。 是当前核酸研究中最常用的方