EPI400电击感受态细胞使用手册.pdfVIP

EPI400 电击感受态细胞 EPI400 Electroporation Competent Cell 编号 名称 规格 北京华越洋 WG 07229 EPI400 电击感受态细胞 10 ×100ul EPI400 电击感受态细胞基因型： F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG trfA tonA pcnB4 dhfr EPI400 电击感受态细胞说明： EPI400 电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。该菌株来源于EC100 菌株， 将EC100 核基因中控制质粒拷贝数的pcnB 基因删除后引入一个诱导启动子驱动的pcnB 基 因，即是EPI400 菌株。EPI400 菌株可以降低质粒的拷贝数，特别适合于各种不稳定DNA 或毒性基因的克隆，在加入诱导剂CopyCutter Induction Solution 后又可以提高质粒产量 到正常状态。[mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI400 菌株适合于克隆富含甲 基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。recA1 和endA1 的突变有利于插入DNA 的稳定和高纯度质 粒DNA 的提取。lacZΔ M15 标记的存在使DH10B 可用于蓝白斑筛选，tonA 赋予其抗噬菌 体T1 和T5 的能力，rpsL 赋予其链霉素抗性。EPI400 电击感受态细胞适用于不稳定DNA 或毒性基因的克隆，经特殊工艺制作，pUC19 质粒检测转化效率1010 cfu/μ g DNA。 EPI400 电击感受态细胞操作方法： 1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5 分钟，待其沥干水分，正置 5 分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置5 分钟充分降温。 2. 取-80℃保存的EPI400 电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质 粒或连接产物)并用手拨打EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。 A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19； B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA 后加入适量TE 缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA 浓度不超过 100ng/μl，体积不超过5μl/50μl 感受态。 3. 用200 μl 枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。 4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐 参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入 冰中。 5. 2min 后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl 不含抗生素的无菌SOC 培养基（室温）， 用 1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml 离心管（BD Falcon50ml 锥形离心管 等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至5ml。37℃，225 rpm 复苏60 分钟。 6. 5000rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的S.O.C 平板上 （因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm 培养皿2-5 个）。将平板倒置放于37℃培养箱 过夜培养 13-17 小时。 EPI400 电击感受态细胞注意事项： 1. 加入DNA 时体积不应大于感受态体积的1/10。 2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。 3. 当DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。 4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA 的溶液中产生电流和弧光放 电的风险。 5. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA 后用适量TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA 浓度不超过 100 ng/μl。过高