PCR技术及应用.ppt

聚合酶链式反应技术及其应用 PCR反应基本原理 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary.B.Mullis在迥然灵感的启迪下发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），实现了人们在体外无限扩增DNA片段的梦想。而Saiki首次应用PCR法成功的扩增了人β-珠蛋白DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。 PCR反应基本原理 Mullis在建立PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一次酶，扩增片段的长度受到限制，操作繁琐。1988年，Saiki把一种耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR后，PCR技术的应用进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中的应用越来越广，据文献报道PCR技术用于检测病原体的种类已超过100多种。 PCR反应基本原理 PCR是体外酶促反应合成特异性DNA的一种方法.它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应,扩增位于两段已知序列之间的DNA片段.主要步骤为:人工合成一对寡核苷酸引物，与待扩增DNA片段两条链的两端分别互补，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。由此可见，PCR就是在引物介导下反复进行“热变性-复性-延伸”而扩增DNA的循环过程。 DNA变性及复性图解 PCR原理 PCR原理 １变性 PCR原理 １复性 PCR原理 １延伸 PCR原理 2 变性 PCR原理 2 复性 PCR原理 2延伸 PCR原理 3变性 PCR原理 3复性 PCR原理 3延伸 PCR条件的选择 进行PCR反应必须具备以下几个条件： .模板DNA .人工合成的寡核苷酸引物 .合适的缓冲体系 .镁离子 .4种脱氧核糖核苷三磷酸 .耐热DNA聚合酶 .温度及循环参数 PCR条件的选择 模板DNA：PCR反应可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增，模板DNA的来源及其制备的效率对PCR扩增有重要的影响。临床检测用模板DNA来源必须根据检测的病原体不同选择最适部位，以取材方便，待测病原体含量高为原则。 PCR条件的选择 引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。 引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好，引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。 引物的末端核苷酸：引物及引物间3’末端不能出现互补，引物间的互补容易导致引物双链体的出现。 合理的GC含量和Tm值：引物的G+C含量一般要保持在50%左右，Tm值50%--70%，Tm值低，扩增的特异性下降，若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能不发挥作用。 PCR条件的选择 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 PCR条件的选择 DNA聚合酶 在其它参数最佳时，每100ul反应液中含1-2.5U(比活性为20U/pmol)Taq DNA聚合酶为佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PCR时，最好在每100ul反应体积中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带；过低时，则靶序列产量很低。 dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dN