乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测.pptVIP

乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测 缪晓辉 2009.5 一、HBV耐药的有关定义 二、各种耐药检测技术的评价 三、需要重视的几个问题 一、HBV耐药的有关定义 病毒学突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化学突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐药（genotypic resistance） HBV表型耐药（phenotypic resistance） 临床耐药（clinical resistance） HBV耐药的有关定义 病毒学突破（virologic breakthrough） 指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。 HBV耐药的有关定义 病毒反跳（viral rebound） 指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。 HBV耐药的有关定义 生化学突破（biochemical breakthrough） 指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。 HBV耐药的有关定义 HBV基因型耐药（genotypic resistance） 指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。 HBV耐药的有关定义 HBV表型耐药（phenotypic resistance） 通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。 通常以IC50来评估 IC50＜5倍:敏感 IC50在5～10倍:部分耐药 IC50 ＞10倍:耐药 HBV耐药的有关定义 临床耐药（clinical resistance） 指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。 二、各种耐药检测技术及评价 病毒学反跳或突破的监测 HBV基因型耐药监测 HBV表型耐药检测 临床耐药监测 病毒学反跳或突破的监测 基于对血清HBV DNA载量的动态监测 需重视以下三点： 1. HBV DNA载量检测手段的敏感性 2.检测技术的可靠性和稳定性 3.监测的间隔时间 HBV基因型耐药监测 时机 非必须 不主张常规、广泛应用 基因型耐药相关变异的命名 基因型耐药相关变异在HBV多聚酶序列中的位置 HBV基因型耐药的主要技术 碱基序列分析法 直接测序 克隆测序 聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP) 反向杂交分析技术（INNO—LiPA） 基因芯片技术 实时荧光定量PCR技术 探针定点突变PCR技术 引物末端碱基定点突变扩增技术 熔解曲线法 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 直接测序法 HBV YMDD变异直接测序结果图谱 直接DNA测序的局限性 1. 设备贵、技术高、耗材、费时。 2.必须有充足目的基因片段。 3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBV YMDD变异1.JPG 克隆测序法 克隆测序法 优点： 1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株 之间的相对比。 2.提高了检测的灵敏度。 局限性： 1.技术难度较高。 2.检测周期更长。 3.检测的费用大大增加。 聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP) 碱基变异可能导致： ① 原有位点消失 ② 产生新的位点 ③ 识别位点移位 限制性内切核酸酶的作用 PCR-RFLP检测HBV YMDD变异 PCR-RFLP检测HBV YMDD变异 PCR-RFLP检测HBV YMDD变异 PCR-RFLP技术的评价 优点： 简单、广泛易开展。 缺点： 1.限制性内切酶种类有限。 2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。 3.引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测 敏感的下降。 反向杂交分析技术（INNO—LiPA） INNO—LiPA