不同畜禽血样采集、哺乳动物白细胞分离.ppt

* * * * * 华中农业大学动物科技学院 实验一 哺乳动物白细胞分离 左 波、柴 进 了解哺乳动物白细胞分离原理 掌握兔及猪白细胞分离方法 明确畜禽血液细胞组成差异 一、实验目的 二、实验原理 真核基因组DNA 存在于细胞核的染色质中 血液 新鲜组织 福尔马林浸泡标本 石蜡标本 冰冻组织 毛发 体腔液 洗嗽液 精液 1 常用于DNA提取的材料： 血液 血 浆（50-60%） 晶体物质 2-3% 水份 90-92% 血浆蛋白 5-8% 血细胞（40-50%） 红细胞 白细胞 血小板 2 血液组成 红细胞 又称红血球或红血细胞，是血液中最多的一种血细胞。红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。 人和哺乳动物的成熟红细胞无细胞核 白细胞 白细胞无色呈球形，有细胞核，体积比红细胞大 光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种 白细胞 有粒 嗜酸性粒细胞 中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 无粒 单核细胞 淋巴细胞 血小板 也称血栓细胞，是体内最小的血细胞，是由骨髓中成熟的巨核细胞裂解、胞质脱落而成，呈圆形、椭圆或不规则的形状，无细胞核。 但它并非只是细胞碎片，它有一定的结构，能进行新陈代谢。 血小板的功能主要是促进止血和加速凝血 血小板遇到粗糙的血管壁伤口，就被破坏并释放出促使血液凝固的凝血酶。这种酶的前身是凝血酶原，在Ca2+参与下，凝血酶原激活物可催化凝血酶原转化为具有活性的凝血酶。 在凝血酶、Ca2+和其它一些因子的作用下，经过一系列变化，可溶性的纤维蛋白原就变成了不溶性的丝状纤维蛋白。这种蛋白形成后，互相交织成网，并把血细胞网罗在内，使原来的血液凝集成块。 3 抗凝 可通过以下几种途径来实现： （1）往血液中加入适量的抗凝剂（如柠檬酸钠）将Ca2+夺去，使其成为失钙血，这样可以防止纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而避免了血液凝固。 （2）用试管刷反复搅拌，取出血液中的纤维蛋白，这种血叫去纤维蛋白血。由于缺少了凝血必需物质（纤维蛋白），所以血液不再凝固。 （3）降低血液温度，使酶的活性降低。 （4）保护血小板，减少凝血酶的释放。 抗凝剂 　（1）乙二胺四乙酸（EDTA）盐，EDTA有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子形成螯合物，从而阻止血液凝固。 Na2C10H14O8N2+ Ca2+→CaC10H12O8N2+2Na++2H+ 适用于全血细胞分析及血细胞比容测定。 （2）柠檬酸钠（trisodium citrate），柠檬酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固 2Na3C6H5O7+2Ca2+→2CaC6H5O7+6Na+ 适用于红细胞沉降率和凝血功能测定。 （3）草酸钠（sodium oxalate），草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。适用于一般普通生化检查 （4）肝素（heparin），肝素的阴离子活性基团与抗凝血酶III（AT-III）的阳离子基团结合，加速抗凝血酶-凝血酶复合体形成，灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，拮抗凝血酶和阻止血小板聚集。此外肝素还有催化抑制凝血因子Ⅹ的作用。适用于血流变检查 从血管取少量血液加入适量抗凝剂,有形成分经自然沉降或离心沉淀后，血液可分出三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血小板 4 白细胞分离 5 细胞破碎 方法 技术 原理 效果 成本 举例 化 学 法 渗透冲击 渗透压破坏细胞 温和 便宜 溶血 酶消化法 细胞壁被消化，使细胞破碎 温和 昂贵 增溶法 表面活性剂溶解细胞壁 温和 适中 胆盐作用于大肠杆菌 脂溶法 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳 适中 便宜 甲苯破碎酵母细胞 碱处理法 碱的皂化作用使细胞壁融解 剧烈 便宜 方法 技术 原理 效果 成本 举例 机 械 法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中 动物组织及动物细胞 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 超声波法 用超声波的空穴作用使细胞破碎 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模处理 匀浆法（孔型） 须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎 剧烈 适中 细胞悬浮液大规模处理 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁珠捣碎 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理 渗透冲击法（Osmotic Shock） 此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。 在血浆中无机盐形成的渗透压称为晶体渗透压 由血浆蛋白形成的渗透压称为胶体渗透压 血浆渗透压的总值为两者之和。 红细胞在此溶液中大小、形状不变，故称