第三章免疫法.ppt

胃蛋白酶 木瓜蛋白酶 巯基乙醇还原 胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，铰链区H链间二硫键（C端） 裂解片段，F（ab’）2，无Fc片段 与抗原结合可发生凝集反应 木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端） 裂解片段，2个Fab（54KD），一个Fc（50KD）,Fab与抗原结合，不发生凝集反应。 2．抗体作为分析试剂的评价 抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需要简单的预处理。有较高的稳定性。 这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一的基础。 此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。 3、抗体的制备 （1）常规抗血清（多克隆抗体）：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。 免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清的分析鉴定。 免疫原的制备 免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。 水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。 弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达到油包水的程度。 不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。 动物免疫 通常的免疫动物为家兔和羊。 免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。 免疫抗原量通常为1~10mg或50~100mg。 试血及效价测定 家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。 不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37℃保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。 （2）单克隆抗体 单克隆抗体是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞 细胞培养法 接种动物体内生产法 制备步骤 2、抗体的纯化 利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。 利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性的抗体。 3、特异性抗体的筛选与效价测定 抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量。 免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释度，此最大稀释度即为血清的效价。 常用的效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和ELISA法等。 一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用 主要内容 四、免疫分析方法及其应用 放射免疫分析法（RIA） 荧光免疫分析法（FIA） 克隆酶给予体免疫分析法（CEDIA） 酶联免疫吸附分析法（ELISA） 放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA） 1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。 由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术. 基本原理 基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合 ,这种竞争可用以下反应式来表示： 抗原 抗体 常用的标记物：125 I和氚标记物 放射性活度（贝克，Bp） 1Bp：每秒一次核衰变 比活度（Bp/g）： 每单位质量所含的放射性比活度 游离状态 结合状态 具体步骤 抗原抗体反应 结合的和游离的 放射性物质的分离 放射性活度的测定 柱色谱法 吸附法 沉淀法 抗抗体发 微孔滤膜法 固相法 求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线） 荧光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA） 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和 敏感性与显微示踪的精确性相结合的一项技术 以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原 荧光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA） 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位 在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术 根据实验方法分类 直接法 间接法 补体法 其他 直接法 将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检 操作简便、特异性高、非特异性染色少