第三章细胞生物学的方法.ppt

（四）主要电镜制样技术 1.超薄切片技术 超薄切片（ultrathin section）： 用于透射电镜观察的极薄标本切片， 厚约40-50nm.通常标本用树脂包埋， 用超薄切片机制备。 2.负染色技术 负染色技术（negative staning）： 一种制备电子显微镜样品图像呈现负反差的技术。 第二节 细胞及其组分的分析方法 一.超离心技术 超离心（ultracentrifugation ）：根据物质沉降系数、质量、浮力因子等不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩提纯的方法。 差速离心:不同离心速度产生不同离心力,将组分分开。 密度梯度离心:将样品放在密度逐渐增加的、形成密梯度的的、高溶解性、惰性物质溶剂（液）表面，在离心力作用下，不同的组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降带。 速度沉降：密度相近而大小不一的细胞组分。（组分的形状和大小） 等密度沉降：密度不同，取决浮力密度。（不依赖与大小和形状） 二.细胞成分的细胞化学显示方法 为测定蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊集团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。 孚尔根（Feulgen reaction，FR）:显示DNA在细胞中的分布 PAS：多糖在细胞中的分布 米伦反应（Millon reaction）:蛋白测定 脂肪酸的细胞化学测定 酶的细胞化学测定 三.特异蛋白抗原的定位和定性 （一）免疫荧光技术 免疫荧光（Immunofluorescence technique ）：指将免疫学方法与荧光标记技术相结合用于研究特异性抗原在细胞内分布的方法。 实验主要步骤：荧光抗体的制备、标本处理、观察记录等. 常用荧光素：ＦＩＴＣ、四甲基异氰酸罗达明 等 根据抗原抗体反应的结合步聚的不同，免疫荧光标记技术可分直接法、间接法、补体法和双重免疫荧光法 25μm （二）免疫电镜技术 免疫电镜（immunoelectron microscopy ）：指将免疫学方法与电镜技术相结合用于研究特异性抗原在细胞内分布的方法。 方法：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术 四．定量细胞化学分析与细胞分选技术 １．显微分光光度技术 ２．流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry）:是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段. 应用：DNA、RNA、蛋白质定量测定 ；细胞分选；膜电位、pH等测定 第三节 细胞培养与细胞工程 一.细胞培养 （一）介绍有关概念 （二）动物细胞培养 1. 动物细胞培养方法 根据细胞生长特性有静止培养（贴壁培养）和悬浮培养；根据器皿可有滚瓶培养、转瓶培养、摇瓶培养、生物反应器培养等方法；根据操作方式可以分为分批式培养，流加式培养，半连续式培养和连续式培养（包括灌注培养）等。 2.细胞原代培养操作程序 取组织 剪碎组织 分离细胞 加培养基 单层 传代 建细胞系 3.常用细胞系 （三）植物细胞培养 1.单倍体细胞培养 2.原生质体培养 二.细胞工程 细胞工程（cell engineering ）:主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。 细胞融合与单克隆抗体技术细胞融合（cell fusion）：是指在离体条件下用人工的方法把不同种的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。单克隆抗体（monoclonal antibody）：将免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经过克隆化，所产生的抗体是高度纯一的单克隆抗体。 DNA生物合成途径示意图 氨基蝶呤 四种 核苷酸 DNA “前体” 核苷酸 “补救途径” TK+ HGPRT+ TMP IMP 胸腺嘧啶 核苷（T） 次黄嘌呤 AMP GMP “从头开始” 核糖+氨基酸 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 一.放射自影技术 放射自现影:利用放射同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用,对生物标本中放射性标记物进行定位和定量的测定方法.这种方法用于细胞学或组织学测定则称为显微放射自显影。 电镜放射自显影技术电镜放射自显影技术是一种利用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，而且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。因此这是一种非常有用的现代生物学技术。 二.荧光漂白恢复技术 显微 操作技术 第五节 模式生物与功能基因组的研究 一.细胞生物学研究常用的