蛋白质与氨基酸测定报告.ppt

（6）说明及注意 此法测定食品中的游离氨基酸； 固体样品应先粉碎，准确称样后用水萃取，测定萃取液；液体样品可直接测定； 样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后测定，或用点位滴定法测定。 （6）说明 本法快速准确，可用于各类样品游离氨基酸含量的测定。 对于混浊样品和深色样品可不经处理直接测定。 3、茚三酮比色法 原理： 除脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨基酸和蛋白质的末端氨基酸在碱性条件下与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物，产生的颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用分光光度法测定，其最大吸收波长为570nm。 本法可适用于氨基酸含量的微量检测。 2、电位滴定法 （1）原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极与甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH判断和控制滴定终点。 (2)、仪器 酸度计、复合玻璃电极、磁力搅拌器、微量滴定管 （3）试剂 ① 20%中性甲醛 ② 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液 （4）操作方法 吸取5.0mL的样品溶液于100mL容量瓶中，定容至标线，吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mo1/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积。 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L的氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积(V1）。 同时取80mL蒸馏水，做空白实验。记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积( V2）。 （5）计算 式中： Vl—样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点(pH9.2 )所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，ml； V2—空白实验在加入甲醛后滴定至终点(pH9.2 )所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，ml； c—氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； V—测定用样品溶液相当于样品的质量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，mg/mol。  2.2 微量凯氏定氮法 (1)原理 微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏定氮器。 ①100ml凯氏烧瓶。 ②微量凯氏定氮器。 (2)仪器 ①2%硼酸溶液。 ?②50%氢氧化钠。 ③0.03%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5混合。 ④0.01000mol/L盐酸标准溶液 ⑤其他试剂同常量法。 (3) 试剂 ①样品消化：样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。 (4)测定方法 ② 蒸馏 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶内加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。 吸取10.00ml样品消化稀释液，由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入400g/L氢氧化钠10ml使溶液呈强碱性，用少量蒸馏 水洗漏斗数次，盖塞 ，进行水蒸气 蒸馏。冷凝管下端 预先插入盛有10mL4%（或2%）硼酸吸收液,蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。 ③ 滴定 取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。 (5) 结果计算 式中W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。 （1）所用试剂应用无氨蒸馏水配制。 （2）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。 （3）若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量泡沫少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。 （4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L2~3ml过氧化氢后再加热。 2.4 注意事项 （5）若