荧光定量PCR.docx

一、 样品RNA的抽提1.匀浆 将-80℃冻结的RNA提取样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状，向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAiso Plus，并将组织样粉末覆盖。2.抽提 室温放置5min，使核蛋白复合物完全溶解后转移至1.5mL无酶离心管中，室温静置5min，12000r/min，4℃离心15min；小心吸取上清液移入新离心管，加上清液的1/5体积量的氯仿，静置10min；12000 r/min，4℃离心10min。（此时分三层：无色上清液、白色蛋白层、带颜色的下层有机相）；3.RNA沉淀 吸取上清液移至新离心管，切勿吸入中间蛋白层，向上清液中加入与上清液等量体积的异丙醇。颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min，4℃离心5min（此时底部会出现沉淀）；4.RNA洗涤 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入1 ml的75%乙醇（用DEPC水或无酶无菌水配制，超净台中配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下12000r/min离心5分钟。5.RNA溶解 吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。加入无RNA酶的水20-40μL用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。二、 RNA浓度和质量的测定1. 1%-1.2%琼脂糖电泳检测RNA的完整性：将从肌肉中提取的总RNA吸取5μＬ，加入1μL 6 X Loading Buffer,混匀，点入1%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，经凝胶成像系统检测条带。2. 核酸蛋白分析仪检测OD；吸取2μL的RNA检测OD260/OD280检测含量与纯度，A260／A280在1.9-2.1之间，说明提取的总ＲＮＡ质量很好，记录稀释后RNA的Conc值（浓度）。三、 实时定量引物实时定量引物根据NCBI公布的基因序列，依据实时定量引物设计原则，使用软件Primer5.0设计，管家基因引物引用参考文献所列，引物由上海生工有限公司合成。四、 反转录 宝生物（大连）工程有限公司TaKaRa Prime Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)进行反转录，体系及步骤如下；1. 反转录制备cDNA第一链采用SYBR Green qPCR法反转录，体系如表。试剂添加量（μL）步骤１的反应液10.0PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0RT Primer Mix*41.05XPrime Script Buffer（for Real Time）4.0RNase Free d H2O4.0Total20 按表成分在冰上配制反应液。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μＬ到每个PCR反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。反转录条件；37℃15min；85℃５sec；4℃24ｈ。经过反转录反应得到的cDNA浓度为50ng/μL，将反转录产物于４℃冰箱中保存。2. 实时定量PCR扩增本试验应用CFX96TMReal-Time PCR Detection System扩増仪的操作方法。使用TaKaRa SYBR⑧Premix Ex TaqTMⅡ（TLi RNaseH Plus）进行实时定量PCR扩增。（1）实时定量PCR反应体系以上一步反转录获得的cDNA为模板，按表组份配制ＰＣＲ反应液（反应液配制在冰上进行）。以GAPDH基因作为参照基因，对样品中MyHCⅠ、MyHCⅡａ、MyHCⅡｂ、MyHCⅡｘ基因在RNA水平进行相对定量分析。目的基因与管家基因分别做３-４个平行样，每个岁龄的羊做10只平行，４次重复。PCR反应体系如表：（2）将配置好的反应体系装入12排八联管中，放入实时定量PCR仪中进行扩増。设置ＰＣＲ反应条件为：（3）经ＰＣＲ扩増反应后，将产物于４℃冰箱中保存。3. PCR反应产物检验吸取2μL的PCR反应产物，加入6 X Loading Buffer混匀，点入1.0%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，用凝胶成像系统检测PCR反应产物的质量。五、数据统计分析实时定量PCR数据分析方法：本试验采用２-△△Ｃｔ法，计算公式：（１）相对表达量（fold change）＝２-△△Ｃt；（２）△△Ｃｔ＝（Ｃｔ目的基因-Ｃt内参基因）处理组-（Ｃt目的基因-Ｃt内参基因）未处理组。1. ?紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260n