拟南芥t-dna插入突变纯合体的鉴定.pptVIP

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 实验目的 1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。 T-DNA插入鉴定的原理 突变体鉴定的步骤 T-DNA插入基因的基因组序列； T-DNA插入方向的确定； T-DNA插入位置的确定； 引物设计； PCR扩增； 电泳检测。 T-DNA插入基因的基因组序列 点击基因编号进入网页 点击sequence viewer进入 点击nucleotide view进入 点击突变体编号后进入的网页 进入网站/cgi-bin/tdnaexpress 查找基因突变体及插入方向 基因方向 T-DNA方向 5’引物 3’引物 实验设计 Ext3=300bp；Bpos=110bp；N=0~300bp. 410+N=Ext3+Bpos+N BPos 引物设计 基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥网站/tdnaprimers.html进行自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp以上为宜，即300+N bp。 LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 植物基因组DNA的快速提取 （1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加入400 ml提取缓冲液； （2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色； （3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟； （4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中； （5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条件下，离心5分钟； （6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀； （7）100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。 （此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增） PCR鉴定 30ml反应体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10×扩增缓冲液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L） 用无菌水补足体积。 PCR反应条件 94℃ 3min 30循环 （94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min）； 72℃ 延伸10min。 注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整。 PCR安排 每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下： 1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。 2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。 046号突变体的鉴定（1-6组） 30ml反应体系1： 2 ml 植物基因组DNA样品（WT） 3 ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5’引物（10mmol/L） 1 ml 0463’引物（10mmol/L） 30ml反应体系2： 2 ml 植物基因组DNA样品WT 3 ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5’引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 30ml反应体系3： 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5’引物（10mmol/L） 1 ml 0463’引物（10mmol/L） 30ml反应体系4： 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 m